大肠杆菌表面展示体系磷酸盐吸附能力的初步研究(2)
参考文献 26
1前言
1.2 有机磷水解酶的大肠杆菌细胞表面展示
PCR扩增来自黄杆菌ATCC27551的有机磷水解酶基因opd ，直接用Xon I酶切与pZXL-T连接，将opd克隆于锚定单元Lpp-OmpA编码序列下游，转化E．coli BL21(DE3)．经抗性筛选、PCR鉴定和测序证实，成功构建了具有全细胞催化效应的大肠杆菌细胞表面展示工程菌．SDS-PAGE结果表明，工程菌能表达产生51KDa的融合蛋白．细胞表面展示的有机磷水解酶具有较高全细胞酶活性，用蛋白酶K消化处理重组菌表面蛋白可使其全细胞酶活降低90％[7]。全世界每年大约要消耗40万t的农药．其中有机磷类农药占到总农药使用量的70%．但真正被害虫吸收的量不到使用量的1％ [8]。Richins等研究表明，表面展示OPH的工程菌讲解对硫磷和对氧磷的速度是胞内表达OPH工程菌株的7倍[9]，而且比纯化的OPH更稳定,活力更强[10]。通过物理吸附将这种新型的生物催化剂吸附到固定载体上，代替固定化OPH，是一种用于杀虫剂脱毒的有效手段.然而在长期的运行过程中，微生物会逐渐的从载体上脱落，从而降低了固化细胞系统的有效性，利用可逆吸附或特殊吸附手段可以提高其稳定性。近几年，国内的有机磷农药生物降解的研究发展迅速，中国农业科学院生物技术研究所范云优尔[11] 等，在有机磷农药降解酶制剂基因工程研究方面也取得了重要进展：南京农业大学的顾立峰等以Pseudomona putida KT2440为宿主菌．成功构建高有机磷降解活性的基因工程菌。但是．目前OPH表面显示技术还存在一些问题．如利用表面显示的OPH 活力相对较低且保持时间短，载体系统的表达效率不高，表面显示系统会出现生长停滞和细胞自溶等现象，大部分研究尚停留在实验室阶段。此外，OPH水解有机磷化合物生成的对硝基酚(P．nitrophenol，PNP)仍是一种难降解化合物，已被美国EPA定为优先污染物。因此，要实现有机磷化合物的完全降解，还必须借助于分离和表达对硝基酚降解基因，这方面还有待科学家们的进一步研究。
1.3 重组质粒的构建
利用质粒pMB103为载体，通过对其酶切位点的改造，引入一个目的基因(204 bp)，构建成一个新的质粒pMB109。
方法：用Sac I和Xba I分别对质粒pMB103进行酶切，0.8％ 低熔点琼脂糖凝胶电泳回收所需片段，将已知DNA 片段用引物进行PCR扩增后。使用T4 DNA连接酶将上述得到的DNA 片段与酶切回收的质粒pBI121 DNA进行连接。结果：将连接产物转化大肠杆菌及筛选与测序公司进行鉴定，最终符合目的要求[12]。
1.4无机磷酸盐吸附研究进展
由于大量含磷污水的排放造成了水体富营养化，因此在此类污水流入环境之前必须通过污水处理的方法，将含磷化合物去除。污水中的磷通常以磷酸盐，聚磷酸盐和有机磷的形式存在，聚磷酸盐在酸性条件下可水解为磷酸盐，有机磷酸盐也可被水中细菌生物酶作用下转化成磷酸盐，因此，磷酸盐的去除是污水除磷的关键。现阶段，污水中磷的去除有多种方法，如化学除磷，人工湿地系统，生物除磷等。
1.4.1化学除磷法[13-19]
化学除磷是使污水中的磷与化学试剂反应生成难溶于水的化合物以达到从污水中除磷的目的。目前主要用来除磷的化学试剂有铁盐、铝盐、钙盐和镁盐等。铁离子絮凝剂是最常用的化学除磷试剂之一。实验证明，FeS04加入污水污泥中能与污水中的磷酸盐反应生成不溶的磷酸亚铁盐，从而沉淀于污泥中与水分离[13]。在曝气池中加入FeCl2也能有效地降低污水中磷酸盐的排放量[14]。三价铁离子的凝胶也能吸附大量的磷酸盐形成难溶化合物，并且生成的化合物本身具有极强的吸附作用[15]。此外，铁离子絮凝剂能和钙离子、铜离子和锌离子等协同作用下除磷[16]。氢氧化铝(AI(OH)3)和氧化铝(A1203)对磷酸盐有着快速高效的吸附能力。氢氧化铝通过与正磷酸盐结合生成磷酸氢氧化铝沉淀从污水中去除[17]。含氧化铝的活性污泥不仅能保持长时间高效吸磷能力，而且即使干燥后或磷酸盐浓度较低的条件下仍能快速结合磷酸盐[18]。钙磷沉淀法因其耗费少、易操作等优点成为一种较常用的化学除磷方法。向污水中加入方解石等作晶核，使其中的钙与磷酸盐结合生成不溶的羟基磷灰石(Ca5(P04)30H)，这一方法除磷率可达到90％以上。在无氧环境下磷酸盐的去除在污水处理的整个过程中是必要的。这样可以提高污水处磷效率。在无氧条件下的污泥中加入氢氧化镁(Mg(OH)2)不仅可以降低磷含量，还可以降低悬浮固体量，化学需氧量(COD)以及提高沼气的产生效率。化学除磷法尽管工艺简单，见效快，除磷效率高，但是污水pH值较高时会造成金属离子形成氢氧化物沉淀，实际投放量往往高出理论投放量很多，无形中增加了成本。同时，为达到除磷目的不得不使污水中金属离子含量提高，超标的金属离子浓度会对生物产生毒害作用造成二次污染[19]。
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