葡萄果实渣中提取多酚及其抗氧化性分析(2)
果渣主要由压皮,种子和茎组成。这些大量副产品对酿酒厂构成严重的环境和污染问题。然而,它们也代表了各种高价值分子的丰富来源,如具有高抗氧化活性的植物化学物质[1-4]。其中在葡萄果渣中,多酚化合物的含量较高,在酿造过程中由于其提取率主要取决于酿造过程中的技术参数,所以仅提取了部分多酚。酚酸和芪类是葡萄果渣的组成成分，同时主要成分也包括黄酮类（如花青素和儿茶素类）[2,4]。越来越多的研究表明葡萄和葡萄酒酚对人体健康具有有益影响,对慢性疾病如癌症,心血管的病变还有神经的变性,酚类物质是具有一定抵抗作用[5]。
葡萄多酚也被证明具有抗炎和抗微生物特性[4,6,7]。由于其生物化学性质,葡萄果渣可提取成分可能有许多应用：作为功能食品和饲料,化妆品和营养品的成分；作为食品的天然着色剂和防腐剂[2-4]。然而,摄入后饮食酚在胃肠道中被改变和降解,并且以低浓度和不同的化学形式出现在循环系统中[5]。
研究表明,除了甲醇、乙醇通常作为酚类化合物的提取溶剂，常用的溶剂还有丙酮或者它们与水组成的混合物。在这些溶剂中甲醇比乙醇在提取的结果中更好,用50%~80%甲醇来提取酚酸和类黄酮,不但能够抑制酶活性,同时提取效果也更好。但是我们通常使用的有机试剂提取法存在危害健康、不安全这样对人体造成危险的缺点，也会造成污染环境等缺陷,因而,近年来呈现了一些新的提取措施,如微波辅助提、超声波辅、超临界流体提取技术、固相萃取技术、加压溶剂萃等。这些新提取方法一般使用水、液化气、有机溶剂或它们的混合物,但是与传统提取法相比,这些方法存在费用昂贵、提取效率不高、一次处理样品数过少、条件难以控制等缺陷,但这些提取方法在特定的研究中展现出重要的作用。
几种分离方法的比较表明,溶剂（主要是水,乙醇和甲醇）和超临界流体萃取对于葡萄果渣提取是最有效的[3,8,9]。使用细胞壁多糖降解酶可促进仍然存在于果渣中的葡萄酚类物质的释放[10,11]。
因为酚类物质易氧化,所以在提取时既要获得多的提取量,同时也要避免氧化和制备液中酶的作用。溶剂提取法分为有机溶剂提取和水溶剂提取。在本研究中,通过酶消化和乙醇为基础,研究了赤霞珠红葡萄果渣的多酚类化合物的提取物。
鉴于其可能在化妆品,保健品和制药行业的应用,测试了提取物的生物活性。本次实验抗氧化的检测方法,主要是采用自由基清除的测定方法,包括了ABTS法、DPPH法、羟自由基清除能力以及超氧自由基清除能力。
1 材料和方法
1.1材料
红葡萄酒渣为2016年采收的赤霞珠处理后的渣,这些材料有中国长城葡萄酒有限公司提供。果渣在60℃的通风炉中处理24 h后放置在20℃的低温冰箱中备用。这些果渣包含果实的果皮、种子。
1.2方法
1.2.1 渣酶消化
用搅拌机加蒸馏水(1:5克/毫升)将果渣粉碎。通过加入不同浓度的酶对粉碎的果渣进行酶解(20 mL液体,1或2%酶体积/果渣),这些酶包括真菌淀粉酶fungamyl（来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶,605 U/mL）,或纤文素酶Celluclast(来自里氏木霉ATCC 26921的纤文素酶),均购自sigma(上海)贸易有限公司（Milano,Italy）。
使用不同的酶处理,在不同的培养时间和酶最佳工作温度下在振荡器（150 rpm）上温育,根据sigma说明书进行（纤文素酶是37℃,真菌淀粉酶是24℃）。在不添加酶的情况下进行的样品处理在相同的条件下进行。培养后,将样品在室温下以5000 rpm离心10分钟。除去上清液,使用微孔过滤漏斗装置的过滤器在真空下过滤,同时储存在-20℃,直到进一步分析。除去上清液后,将剩余的沉淀物与30 mL的95％（v/v）乙醇在24℃下在振荡器（150 rpm）上孵育过夜。随后,通过在室温下以5000 rpm离心10分钟将乙醇上清液与沉淀物分离,并通过过滤器过滤。水溶液和乙醇上清液在-20℃下储存直到进一步分析。
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