盐胁迫下水稻种子萌发期的表型鉴定及QTL定位(2)
为了挖掘种子活力相关基因，在前期工作中，利用太湖流域高耐盐粳稻品种韭菜青[17]材料进行实验。近来，以IR26为背景构建了强耐盐地方品种韭菜青染色体片段置换系和近等基因系群体，利用构建的群体在高盐胁迫下（250mM NaCl）鉴定到1个稳定的种子萌发期耐盐株系。该株系在低温（16°C）条件下也表现出快速发芽的特性，有可能该QTL表现一因多效的功能。利用这个耐盐株系的F2分离群体，结合SSR分子标记，以期获得在低温及盐胁迫条件下控制种子发芽速度的QTL。
1 材料与方法
1.1 供试材料
韭菜青（耐盐性粳稻品种）和IR26（中度盐敏感籼稻品种）亲本，以及以韭菜青为供体亲本，IR26为轮回亲本连续回交获得的染色体片段置换系（CSSLs）。
1.2 田间种植
所有的材料于2016年种植在江苏省南京农业大学江浦试验站。6月中旬左右，将亲本及染色体片段置换系（CSSL）群体的30天秧龄的幼苗进行移栽。每个亲本和家系各种3行，种植的行间距为17 cm×33 cm[7]，大田管理按照当地常规的水稻栽培管理方法。收取完熟的种子，将于45℃烘4天，以打破种子休眠，放置-20℃冰箱保存，备用。
1.3 种子萌发耐盐鉴定
取饱满的50粒种子，用0.1% HgCl2消毒，15 min后自来水冲洗三次，再将种子均匀置于含有滤纸的培养皿（直径9cm）中，加入20 mL（0mM、100mM、200mM、250mM、2750mM和300mM NaCl）的盐溶液。然后，置有种子的培养皿放于40cm×30cm×18cm的塑料箱中，盖上保鲜膜，防止水分蒸发。种子在光照培养箱中（12h/12h光照、黑暗）萌发10天，每天记录种子发芽数。种子发芽标准以胚根长大于或等于种子长度为准。计算第7天和10天的种子成苗率（SP）和发芽指数（GI），计算方法参考Wang等[18]。实验重复3次。
1.4 基因型分析
（1）DNA提取步骤如下：
1. 取水稻叶片，放入2.0mL离心管，加入液氮研磨成粉末；
2. 加入500µL的CTAB缓冲液（2%CTAB，100mMTris-HCl，20mM EDTA，1.4MNaCl，pH=8.0），均匀混匀，放置在65℃烘箱中30分钟并每隔5min振荡一次；
3. 加入300µL的氯仿/异戊醇(24:1)混合液,颠倒混匀；
4. 置于65℃烘箱20min；
5. 12000rpm离心10min；
6. 吸取上清液400ul转移至新的1.5mL离心管；
7. 加入400ul-20℃下预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀后置-20℃沉淀30min以上；
8. 12000rpm离心5min，弃上清，75%乙醇洗涤5min；
9. 倒置自然风干后溶于150ul无菌纯水中，并于-20℃冰箱中保存。
（2） PCR扩增体系
PCR扩增反应总体积为10µL,包括1µl DNA模板，1µl 10×缓冲液（含25 mM MgCl2），1µl 4 pmol/µl上、下游引物，0.2µl 2 mM dNTP，0.1µl Taq DNA 聚合酶，加水补足 10µl。反应程序：95℃变性5min；35个循环：95℃变性40s，55℃-60℃(视引物而定)退火40s，72℃下延伸40s；最后，72℃下延伸10min。
（3）电泳和银染体系
制胶 40ml 8%的聚丙烯酰胺凝胶，再加入40µl TEMED 和400µl 10%过硫酸铵（AP），轻轻混匀，将其倒入垂直玻璃板夹层中，插上梳子直至聚合凝固。电泳 在凝胶玻璃板固定在加宽双垂直电泳槽上，加入0.5×TBE 缓冲液，慢慢拔去梳子。10µl PCR产物中加入1µl Loading Buffer，上样量为2.5µl，200V电压，电泳1-2h。其中，Loading Buffer配方为：0.25g溴酚蓝，0.2g二甲苯氰FF，40g蔗糖，用ddH2O定容至100ml，室温保存备用。