有研究表明，即使是少量的多菌灵，也可对哺乳动物产生致癌、致畸作用因而影响后代繁衍等因素，我国于2002年将其列为环境激素类化学农药[3]。多菌灵在工农业上的广泛应用以及对环境造成的严重污染，而微生物降解又是去除环境中多菌灵的主要途径。因而，分离筛选能够高效降解多菌灵的微生物是修复多菌灵污染土的重要手段。

据资料查明，多菌灵降解菌株不能开环，而只能利用多菌灵分子结构中的侧链部分[4]。大多数降解菌是通过把多菌灵转化为某种中间代谢产物进而将其降解，例如菌株Rhodococcus jialingiae djl-2-2 通过2-氨基苯并咪唑，2-羟基苯并咪唑等将多菌灵转化邻苯二酚结构，再通过邻苯二酚开环途径将多菌灵中的苯环结构打开[5]；菌株Pseudomonas sp．CBW 也是把多菌灵转化成2-氨基苯并咪唑，2-羟基苯并咪唑；而菌株CBW则是将2-羟基苯并咪唑转化成邻苯二氨，进而脱氨基形成邻苯二酚，再通过邻苯二酚开环途径达到多菌灵的彻底降解[6]。目前，国内外关于多菌灵降解菌的报道很少，分离到的多菌灵降解菌有红平红球菌Rhodococcus erythropolist[5,8]和Rhodococcus qingshengii[5,9]、Rhodococcus jialingiae[4]、罗尔斯通氏菌属Ralstonia sp．[6]、短小芽孢杆菌Bacillus pumilus[11]、假单胞菌属Pseudomonas sp．[10]、木霉菌属Trichonderma sp．[1]、诺卡氏菌Nocardioides sp．sG-4G[7]。

目前国内外报道的多菌灵降解菌以红球菌属和诺卡氏菌属等革兰氏染色阳性菌株为主，仍然缺少高效的多菌灵降解菌株资源，需要不断丰富多菌灵降解菌种资源库。本研究中已经分离纯化出分枝杆菌属多菌灵高效降解菌株，丰富了多菌灵降解菌种资源，并对其降价多菌灵的特性及环境因子对降解的影响等做了初步研究。

1 材料与方法源'自:优尔`!论~文'网www.youerw.com

1.1供试菌和试剂

试剂：多菌灵原药、二氯甲烷（分析纯）、甲醇(色谱纯)

供试菌：采自多菌灵废水处理系统的活性污泥筛选得到菌株djl-10

1.2 培养基

LB培养基：NaCl 10.0g；蛋白胨 10.0g；酵母粉 5.0g；去离子水 1000ml；pH 7.0～7.2。

无碳培养基：NaCl 1.00，K2HPO4  1.50，KH2PO4  0.50，NH4NO3 1.00，MgSO4·7H2O 0.20，去离子水1000mL。

无氮培养基：葡萄糖 1.00，NaCl 1.00，K2HPO4  1.50，KH2PO4  0.50，MgSO4·7H2O 0.20，去离子水1000mL。

富集培养基：在无碳培养基中添加0.01%的多菌灵原药作为唯一碳源。

分离培养基：无机盐培养液，多菌灵15g，琼脂18g。pH值7.0~7.2。

1.3 实验方法

1.3.1 多菌灵降解菌的富集与分离

取2.0g活性污泥于20mL富集培养基中,37℃，170r/min振荡培养7d，再以5mL接种至新鲜富集培养基中，继续培养7d。连续接种5代，然后取200μL培养菌液均匀涂布于含多菌灵的固体无机盐培养基中，37℃培养至平板上出现菌落，将菌株转接到LB培养基上，37℃恒温培养，反复纯化至纯培养后，转接到分离纯化培养基中继续摇床培养，利用HPLC检测多菌灵降解。

1.3.2 菌落形态及菌株显微观察

通过在LB固体培养基中添加过量多菌灵制备浑浊平板，在平板上按照三点法接种菌株djl-10，37℃培养5d，观察菌团周围形成的透明降解圈。另外，在LB固体培养基平板上划线接种，放入恒温箱37℃培养3d，观察菌落形态。用接种针在平板上挑取少许降解菌，放到事先滴有水的载波片上烤干，革兰氏染色后用油镜观察。

1.3.3 菌株16S rDNA的扩增与序列分析

采取SDS高盐沉淀法提取菌体总DNA[11]。挑取LB平板上的单菌落，接至100mL的LB液体培养基中扩大培养。离心收集菌体，加等体积的TEN洗涤菌体，离心收集菌体，悬浮于10mL TE中，加入100μl溶菌酶（100mg/ml），37℃水浴1h，加入40μl蛋白酶K（20mg/ml），再加入300μl 20%的SDS，37℃水浴过夜（约12h）。加入1/2体积饱和NaCl剧烈振荡，12000 g离心10min，上清用等体积酚：氯仿抽提2次，12000 g离心10min，收集上清，加入等体积TE（稀释调整NaCl浓度），0.6倍体积异丙醇沉淀，12000 g离心15 min，70%乙醇洗涤沉淀，乙醇挥发后溶于100μl TE中。