为了研究GASBD2-转基因平台技术中的GASBD2对马铃薯淀粉形态和理化性质的影响，将转基因马铃薯的淀粉形态和理化性质与未转基因的马铃薯进行比较。研究转GASBD2基因马铃薯株系的淀粉形态和理化性质有没有发生改变，从而明确GASBD2-转基因平台技术中GASBD2基因本身对淀粉形态及理化性质是否有影响。

1　材料与方法

1.1 材料与试剂

转GASBD2基因马铃薯、TBS缓冲液、一抗、二抗、淀粉样品。

1.2 方法

1.2.1  马铃薯淀粉的提取

将每个转基因株系中的5株马铃薯植株的薯块，混合。取0.5kg的马铃薯薯块洗净削皮，切成2cm到3cm的小块。首先在组织匀浆机中加入1L含有Na2SO3的去离子水和薯块，进行匀浆。用4层纱布将匀浆液过滤，然后用2 L含0.1% Na2SO3的去离子水冲洗滤渣。将滤液置于4℃冰箱中静置12h，去掉上清液，用去离子水洗涤沉淀三次，将洗涤后的沉淀平铺在滤纸上，晾干。最后将晾干的淀粉研磨成粉，从而得到马铃薯淀粉。

1.2.2  Western斑点杂交分析

用Western斑点杂交的方法[3]来分析转基因淀粉中GASBD2重组蛋白的积累量。取20mg转GASBD2基因淀粉，加入2×SDS样品缓冲液200μL，煮沸5分钟。冷却至室温后，用Mini Trans-Blot System 将转GASBD2基因淀粉凝胶中的GASBD2蛋白印迹转移到硝酸纤维素膜上。电转移条件为：200mA，4℃，120min。首先将转印后的硝酸纤维素膜放置于80mL封闭液中，于室温下封闭过夜。然后用10mL TTBS缓冲液洗膜4次，每次洗涤10min。加入适量的用TBS缓冲液1：500稀释的一抗，在室温下进行温育，温育时间为2h。用TTBS缓冲液洗膜3次后，加入用TBS缓冲液1：500稀释的二抗，在室温下温育，温育时间为2h。再用TBS缓冲液进行清洗，重复洗涤3次，每次洗涤5min。最后用显色液显色2-3min。每个样品重复测定3次。文献综述

1.2.3  淀粉颗粒形貌的观察

取少量的转GASBD2基因马铃薯淀粉样品到载玻片上，用浓度为0.05% I2/KI溶液将淀粉颗粒染色，涂布均匀，盖上盖玻片。用光学显微镜，在40倍镜下观察淀粉颗粒形貌并拍照记录。

1.2.4 淀粉糊化性质的测定 

采用RVA-3D型的快速粘度分析仪，分析淀粉在加热过程中的糊化特性[4]。准确称取2 g干淀粉样品，加入去离子水将干淀粉配成浓度为8 g/100mL的淀粉乳。将RVA分析程序设定为：10s内转速由960r/min下降到160r/min并保持恒定，50℃保温1min，在3.75min内以12℃/min将温度从50℃上升到95℃，95℃保温2.5min，在3.75min内以12℃/min将温度从95℃下降至50℃，在50℃下保温2min。RVA的特征值主要包括峰值粘度(peak viscosity)、回生值(setback)、糊化温度(pasting temperature)等。每个样品重复测定3次。

1.2.5 淀粉热力学性质的测定 

用差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimetry, DSC)测定马铃薯淀粉的DSC特征参数[5-6]。准确称取2.5mg干燥的淀粉样品，置于铝制的样品盘中，加入7.5μL去离子水，称重并记录淀粉样品的质量。将装有淀粉样品的铝盘密封，置于4℃的冰箱中进行平衡，平衡时间为12h，在分析前取出，置于室温下回温1h。空白对照为密封好的空铝盘，放入TGA/SDTA851e 热重/差热同步分析仪中进行测定。将DSC分析参数设定为：升温速率为10℃/min，加热温度范围为30-120℃，样品室N2流量为30mL/min。从DSC曲线上可计算出淀粉糊化的起始温度(onset temperature, To)、峰值温度(peak temperature, Tp)、终止温度(completion temperature, Tc)和淀粉糊化的焓变。每个样品重复测定3次。 来!自~优尔论-文|网www.youerw.com

2   结果与分析

2.1  GASBD2基因在马铃薯中的蛋白表达分析