2.2方法

2.2.1 外植体培养

(1)无AA（氨基酸）缓冲液处理：首先取三只母鼠在细胞间进行无菌操作（注意母鼠必须在细胞间外杀死然后放入酒精中浸泡15min，从物品传递窗传入细胞间）。然后取乳腺组织3份，分别放入装有D-Hanks液（无酚红）的培养皿中清洗干净。用消过毒的剪刀取一小块组织，将其剪成约1mm³左右的组织小块。在6孔板中每孔加入3ml的D-Hanks液，并分别标记为乳-1（R-1），乳-2（R-2），乳-3（R-3）。从各个培养皿中挑选出15块组织小块，分别放入到对应的孔板中。无AA缓冲液处理2h。(2)抑制剂处理15min：第一组加D-Hanks 液，标示为R-1；第二组加50μL DMSO，标示为R-2；第三组加50μL Lactisole，标示为R-3；(3)含抑制剂培养30min：第一组加入DMEM 6ml；第二组加入DMEM 5940μL，60μL DMSO；第三组加入5940μL DMEM和Lactisole抑制剂60μL。培养30min。(4)取组织：培养30min后，将组织小块用镊子轻轻夹出，转移到提前放入冰中预冷的2ml EP管中，夹好后迅速插入冰中。文献综述

2.2.2 提取蛋白

(1)称重：称取空的2ml EP管重量并做好记录。将装有组织小块的2ml EP管放在电子天平上称重，分别记好数据。称好后要立即插入冰中，防止蛋白变性。 (2)配制匀浆液：根据所记录的数据，计算出组织小块的净重。按实重配置匀浆液，计算方式=实重×3×1000=所需匀浆液重量（单位为μL）。首先将PhosSTOP稀释10倍（10×P酶），将cOmplete Protease Inhibitor Cocktail稀释25倍（25×C酶）。以50μL为例：加入10×P酶5μL, 25×C 2μL, 10×PBS 5μL和38μL的ddH2O。配制匀浆液时将3个样品组织总重量计算出来，并且计算出3种样品各需多少匀浆液，一起配制匀浆液，并且配制时要多配制一些，防止因误差而使匀浆液不够。称取之后，本实验组织共重0.3398g，需配制1020μL匀浆液，为防止匀浆液不够，本实验配制1900μL 匀浆液：10×P酶190μL,25×C 76μL,10×PBS 190μL和1444μL的ddH2O 。将配制好的匀浆液分别加入到放有组织小块的EP管当中。R-1中加入378μL 的匀浆液；R-2中加入317μL 的匀浆液；R-3中加入325μL 的匀浆液；(3)匀浆破碎：在加入匀浆液的每个EP管中加入1颗处理好的研磨珠（取出研磨珠在10ml的离心管中用蒸馏水震荡洗涤3次，再用75%的无水乙醇振荡洗涤3次，放入烘箱中125℃ 10分钟后取出，冷却后，浸没在无水乙醇中保存），进行配平。将配平好的样品管放入混合球磨仪适配器的相同位置一一对应，将适配器旋紧，匀浆破碎30s。(4)离心取上清：将匀浆好的样品放入离心机，14000r/min离心20min，然后取上清到标记好的1.5ml EP管中。

2.2.3 BCA定量

(1)配制BCA工作液和蛋白质标准液：每个样品做3组平行对照，因此共有9个样品，按照每个样品加入200μL的BCA工作液，为防止误差导致BCA工作液不足，配制10个样品量，共需配制2000μL的BCA工作液。按照A液：B液=50:1的比例计算出A液和B液的量，上下颠倒混匀。备用。 (2)在96孔板中先用记号笔在盖子上做好标记，选取一角进行配制，以免错记。蛋白质标准液需与样品同时配制。样品配制时首先取16μL的1×PBS加入到每个孔中，然后取4μL的蛋白样品，最后再加入200μL的BCA 工作液，全部加入后立即盖好盖子放入37 ℃保温箱中培养30min。 (3)用Synergy 2 多功能微孔板检测仪测出每个样品的OD值（OD值为稀释后上清液中蛋白浓度）。2.2.4 Western blot

(1)计算加样量：根据测得的OD值，算出所需样品量。按单次上样20μg计算。计算出每孔加样体积为5.7μL。(2)煮样：配制上样样品量（10次加样量），R-1取27μL上清，补加13μL Loading Buffer和17μL ddH2O；R-2取35μL上清，补加18μL Loading Buffer和3μL ddH2O；R-3取25μL上清，补加12μL Loading Buffer和20μL ddH2O。将配制好的样品混合均匀， PCR仪中95 ℃ 煮样10min，目的是为了使蛋白质变性。(3) SDS-PAGE配制：将玻璃板固定好，用ddH2O检验15min，看是否会漏。每次配制两块胶一起进行电泳。分离胶需配制10%的和6%的胶，每块胶都需配制5ml（配方：10%分离胶需ddH2O 1.9ml，30% Acrylamide 1.7ml，1.5MTris-HCl（PH8.8）1.3ml，10%SDS 0.05ml，10%过硫酸铵0.05ml，TEMED 0.002ml；6%分离胶需ddH2O 2.6ml，30% Acrylamide 1.0ml，1.5MTris-HCl（PH8.8）1.3ml，10%SDS 0.05ml，10%过硫酸铵0.05ml，TEMED 0.004ml，注意最后再加入TEMED，且加入后上下颠倒几下立刻灌胶）。配制好后加入玻璃板中，从一个角加入到适宜的高度，然后从中间加入去离子水压平。等看到明显分界线的时候就说明分离胶已经凝固好，小心的将上面的水倒掉，然后加入配制好的5%的浓缩胶（浓缩胶要配制2块，5ml，配方：ddH2O 3.4ml，1.0M Tris-HCl（PH6.8）0.63ml，10%SDS 0.05ml，TEMED 0.005ml, 10%过硫酸铵0.05ml，30% Acrylamide 0.83ml）。按照上面相同的方法加入，加好浓缩胶后进行括梳（有字面向外），括好之后再补加一些浓缩胶在上面。(4)拔梳：浓缩胶凝固之后，将玻璃板组装好来!自~优尔论-文|网www.youerw.com ，放入电泳槽内，加入一些电泳缓冲液在两板之间，看是否会漏，不漏的话继续加入电泳缓冲液，点样前再将梳子拔掉（拔的时候一定要缓慢的拔，防止将浓缩胶破坏掉）。(5)点样：将样品点到对应的孔内，记好顺序：左边开始点三个Loading Buffer，一个marker，然后依次为R-1，R-2，R-3，最后三个Loading Buffer。 (6)跑电泳：盖电泳槽的盖子时，一定要红对红，黑对黑。刚开始80V电压跑30min，然后换到120V跑30min后，看一下跑到哪个部位了，等蓝色标记线跑到绿色板下边沿时停止电泳(切记要随时观察，防止跑出去)。 (7)切胶：根据marker条带，选择我们想要的蛋白样点，GAPDH是37KDa，需切下25-55KDa胶；P-S6为32KDa，需切下25-40KDa的胶；S6为32KDa，需切下25-40KDa的胶；mTOR为289KDa，需切下170KDa以上的胶；Tubulin是55KDa，需切下40-70KDa胶(切胶时尽量将胶切大一点，距离比较远的片段在同一块胶上切，距离近的重新跑胶再切，防止距离短而将蛋白样品所在胶条切掉)；分别量出胶的长度和宽度后将切下的胶放入转膜Buffer中（注意不要使胶干掉）。根据记录的长和宽剪下相同大小的PVDF膜。在每块膜右上角剪一个角做记号。 (8)转膜：将剪好的PVDF膜先放入甲醇（活化PVDF膜上面的正电基因，使其能更容易与带负电的蛋白质结合）中激活10s，再放入转膜Buffer中10min。准备4块厚的滤纸，用转膜Buffer浸润。转模板（黑在下，白在上）一层海绵垫，然后放上一层浸润好的滤纸，将胶条放到滤纸偏上部位，上面再放上PVDF膜（轻轻放上，不允许将其接下再放。对齐，不要产生气泡），然后再放上一层滤纸，用玻棒赶出气泡后，加上海绵垫，将转膜板夹上。黑对黑放入电泳槽中，倒入转膜Buffer，加入冰槽，350mA恒流1h。(9) 封闭（全程在摇床上进行）：转膜完成后将转好的膜轻轻取下（有蛋白面朝下），放入装有1×TBST的培养皿中（一条膜放入一个培养皿中，防止叠加对实验产生影响。每个培养皿写上对应的名字，防止弄混），在摇床上清洗5min。将1×TBST倒出，加入BSA封闭液封闭1h。封闭结束后，用1×TBST洗4次，每次5min。洗完后加入对应的一抗（1:1000），4℃过夜。(10)回收一抗，用1×TBST洗4次，每次5min。加入对应的二抗，室温孵育1h。(11)回收二抗，用1×TBST洗4次，每次5min。(12)显色：遮光配显影液（1:1配制），现配现用，将洗好的膜放入多色荧光/化学发光成像工作系统当中，膜正面向上，用吸水纸吸取多余的水，在膜上加显影液，用吸管涂抹均匀，然后曝光观察收集数据。