1.2.2 接种

在灭菌后的超净台上,取出消毒后的常山胡柚外植体,用消毒且冷却后的解剖刀将幼芽切成小块,用消毒且冷却后的剪刀将胡柚茎剪成长度为0.5~0.8 cm的小段,较为幼嫩的茎,为了避免组织被烫伤,可以用解剖刀小心切成0.4~0.6 cm的小段。用消毒且冷却后的解剖刀将处理后的叶片分成指甲盖大小(2~3 cm2),并在叶片上划出伤口。将处理好的材料接种到不同组合的MS培养基中,每瓶接种3~5个外植体。

1.2.3 幼胚离体培养

培养基:1升培养基需琼脂7 g,蔗糖30 g,加入不同浓度的6-BA。

在温度22 ± 2℃,光照1000~1200 lux条件下进行光照培养。根据外植体的生长情况,每25~45天将材料转移到新的培养基上,及时观察生长变化情况并拍照记录。定时清理培养室,避免菌种的衍生。若出现染菌现象,需及时将未感染的材料转移到新的培养基上,并对染菌材料进行灭菌处理。

2  结果与分析

每种实验因子接种20个外植体,选择不同时期,重复实验。培养基为MS添加不同浓度的植物激素。为保证营养物质充足,材料在每一种培养基上,每间隔30~50天,转接一次。

2.1 常山胡柚幼叶培养结果

在MS+6-BA不同浓度系列的培养基中接种幼叶后,培来.自>优:尔论`文/网www.youerw.com 养15天左右,少数叶片出现黄化死亡,大部分叶片出现卷缩现象,进一步培养后形成愈伤组织,极少数在叶片靠近茎生长的一端,直接形成新芽和新叶(表1和图1)。

在纯MS培养基中,叶片卷缩率为10%,随6-BA浓度的增加,呈现先增加后减少的趋势,在1.0 mg/L 6-BA浓度的培养基中,叶片卷缩率为实验组内最高,达到95%;在纯MS培养基中,黄化死亡率为10%,随6-BA浓度的增加,呈现先减少后增加的趋势,在1.25 mg/L 6-BA浓度的培养基中,叶片黄化死亡率为实验组内最低,无黄花死亡的叶片;在纯MS培养基中,叶片形成愈伤组织的比率为0,随6-BA浓度的增加,呈现先增加后减少的趋势,在1.5 mg/L 6-BA浓度的培养基中,叶片形成愈伤组织的比率为实验组内最高,达到75%;实验中培养的叶片,在含6-BA的培养基中没有直接形成丛生芽。

少数叶片的黄化死亡,可能是材料成熟程度过高,不利于脱分化;也可能是材料处理的时候剪刀、解剖刀等器材消毒后,冷却程度不够,剪叶片或划出伤口时将叶片组织烫伤,影响了组织对营养物质的吸收。

极少数在叶片靠近茎生长的一端,直接形成和新芽新叶,可能是由于叶片基段保留有芽原基或叶原基,且在材料处理过程中没有受到严重的损伤,得以大致保留下来,在适当的培养条件下,直接发芽或抽叶。

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