3。7  重组子的酶切 15

3。8  重组子的序列测定 16

结  论 18

参 考 文 献 19

致  谢 20

1  前言

1。1  研究背景 

纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上储量最丰富的可再生资源。然而，目前纤维素大约80%未被开发利用，只有少部分的用于造纸、纺织和生物饲料等，因此具有极为诱人的开发前景[1]。现在世界能源资源短缺，化石燃料资料日益枯竭，各国争夺战日益激烈，在这种时代背景下，利用生物质能源可有效的缓解能源危机和环境危机。其中使用液体燃料乙醇去代替化石燃料，使液体乙醇成为世界各国首选的生物能源。大多数的乙醇均是从粮食和糖类中获取，随着世界粮食危机的出现，这个来源便太过于奢侈，因此人类将目标转向了利用率很低的木质纤维原料上。目前，影响木质纤维资源生物转化的障碍很多，需要一定的现实基础，其中最大的障碍就是纤维素降解酶的生产效率和使用效率都非常低，从而导致纤维素酶的使用成本要占总成本的25-50%。纤维素的分子式是(C6H10O6)n，它是β-1,4-糖苷键相连接的无分支长链，不溶于水及一般有机溶剂，与其他多糖所不同的是它天然存在结晶结构。在统计学上，纤维素的结构是连续的，它从完全不定形状态到完全结晶化状态，中间存在很多其它层次结构[2]。

纤维素酶是实现秸秆等废弃木质纤维素水解到单糖，继而发酵生产生物乙醇和其他化工产品生产中最为关键的环节之一[3]。但其生物产纤维素酶效率较低，生产成本又比较高，因此纤维素酶的投入使用率和推广率受到了限制。目前关于纤维素酶生产菌株的研究，绝大部分集中于绿色木霉（Trichoderma viride）和里氏木霉（Trichoderma reesei）等菌株上[4]。里氏木霉（T。 reesei）是目前筛选的产酶量最高的优良菌株之一，酶活较高，酶系较全。本实验就是通过本实验以里氏木霉Rut C-30为研究对象，通过对里氏木酶β-葡萄糖苷酶cel1a的克隆，为研究分析β-葡萄糖苷酶cel1a在里氏木霉纤维素酶的表达及其酶活的影响作准备。有利于解决目前利用秸秆等木质纤维素废弃物生产液体燃料和大量化学药品生产过程中的瓶颈问题。为下一步更好的通过分子手段改造里氏木霉，提高里氏木霉产纤维素酶的水平，降低工业生产纤维素酶的生产成本，为实现变秸秆废弃物为人们一直寻求的可再生的清洁能源奠定理论基础。也将为工业生产选用低廉高效的诱导分子，更能为我们提供菌体改造的靶点以构建纤维素酶高产菌株，从而使生产生物燃料所需的纤维素酶制剂成本降低，提供了理论基础和科学依据。

1。2  β-葡萄糖苷酶的理化性质

纤维素酶，又称纤维素酶系。1904年，纤维素酶在蜗牛消化液中首次发现。经研究得知纤维素酶是不是单种酶，而是降解纤维素生成单糖葡萄糖的酶的总称，是起协同作用的多组分酶系。在一般情况下，一个纤维素酶中存在着十几到几十个组分[5]。纤维素酶分子一般由3个部分组成，包括球状的催化结构域(CD)、纤维素结合结构域(CBD)和连接桥(Linker)[6]。 彻底降解纤维素最少需要3种酶，包括：外切葡聚糖酶（EC3。2。1。94)、内切葡聚糖酶（EC3。2。1。4）以及β-葡萄糖苷酶（EC3。2。1。21）[7]，其中外切葡聚糖酶通过水解β-D-1,4-葡萄糖苷键，每次使纤维素切下一个纤维二糖分子。内切葡萄糖苷酶将纤维素内部的无定形区域通过随机水解β-1，4-葡萄糖苷键，从而产生大量带非还原性末端的小分子糖苷键。β-葡萄糖苷酶把纤维二糖降解成单个葡萄糖分子。因此只有它们协同作用下，纤维素分子才能被完全降解成葡萄糖单糖[8] 。β-葡萄糖苷酶对整体纤维素酶的酶活及其诱导表达起到双重重要的作用，其作用如图1所示。研究发现，β-葡萄糖苷酶在纤维素的水解过程中起着关键作用[9]，是纤维素水解成葡萄糖的限制因素。