β-葡萄糖苷酶在调控纤维素酶的酶活及其表达的双重作用

Liebig和Wohler于1837年在苦杏仁汁中首次发现了β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase），又称β-D-葡萄糖苷水解酶，又名纤维二糖酶、苦杏仁苷酶和龙胆二糖酶，属于水解酶类。β-葡萄糖苷酶的作用底物非常多，根据底物特异性，β-葡萄糖苷酶可以被分为芳基葡萄糖苷酶（作用于芳基-β-葡萄糖苷）、纤维二糖酶（水解纤维二糖）和多底物特异性酶（可作用于多种底物）。目前为止，大多数β-葡萄糖苷酶都被归为最后一类。正是由于β-葡萄糖苷酶的多种作用，使β-葡萄糖苷酶广泛分布在自然界中，对于生物的新陈代谢具有重要的意义。多种植物、动物、真菌、细菌及古菌体内都含有β-葡萄糖苷酶。由于它的结构和组成不同，造成不同来源的β-葡萄糖苷酶的相对分子量差异很大[10]。大多数的β-葡萄糖苷酶最适pH集中在酸性区域，但也有例外，有些酶的最适pH却偏碱性。里氏木霉基因组中含有11种β-葡萄糖苷酶编码基因，这些β-葡萄糖苷酶在纤维素降解过程中对纤维素酶的作用并不了解。β-葡萄糖苷酶cel1a、cel3a和cel1b三个β-葡萄糖苷酶编码基因在纤维素降解中含量最为显著[11]。到现在为止，已经有上百个微生物的β-葡萄糖苷酶编码基因得到克隆[12]。研究表明，里氏木霉β-葡萄糖苷酶在纤维素降解过程中有着重要的作用，但是详细的作用机制并不清楚。外源添加β-葡萄糖苷酶抑制剂能够显著提高纤维二糖的诱导能力[13]。本实验利用分子生物大多数学手段将β-葡萄糖苷酶cel1a从里氏木霉中提取出来，使之成功得到克隆，将其导入大肠杆菌中让其正确表达。从而为今后进一步研究β-葡萄糖苷酶cel1a基因其对里氏木霉纤维素酶的表达及其酶活的影响奠定了基础。

2  材料与方法

2。1  实验材料

2。1。1  菌株与质粒

本实验选用大肠杆菌（Escherichia coli DH5a）作为克隆宿主，质粒DNA保存在大肠杆菌体内，选用里氏木霉Rut C-30，选用一个含有T-DNA的二元载体pCAMBIA1300，Kanr，Hygr，均由淮阴师范学院生命科学院研究室保存。论文网

2。1。2  主要试剂及培养基

    PCR引物由赛百盛基因技术有限公司合成，XbaI、HindⅢ、T4 DNA Ligase、Taq DNA Polymerase、Fastpfu酶、各种DNA Marker、RNase酶、Fastpfu酶均购于宝生物工程(大连)有限公司（TaKaRa），exDNA导纳凝胶回收试剂盒购自淮安百慧公司，dNTPs购于北京佳兰生物科技有限公司，分子生物学试剂购自TaKaRa，北京索莱宝科技有限公司等。PDA培养基、LB 培养基[14]。

2。2  实验方法

β-葡萄糖苷酶cel1a的克隆将采用图2所示的技术路线。将β-葡萄糖苷酶cel1a从里氏木霉Rut C-30提取出来，以里氏木霉基因组DNA为模板，通过设计特异性引物，将β-葡萄糖苷酶cel1a和启动子分别进行克隆，然后将β-葡萄糖苷酶cel1a的基因序列通过重叠PCR的作用连接在看家基因（β-actin）的启动子后面，因为两者具有重叠序列，通过酶的作用可将其第一个密码子连接在β-actin的启动子后第一个的密码子位置上。并将其克隆到二元载体pCAMBIA1300中，这样各β-葡萄糖苷酶的表达将受β-actin的启动子的控制。最后经过测序检测后导入受体细胞中，进行低温保存。

Overlapping PCR   克隆到pCAMBIA1300二元载体中

     pCAMBIA1300的克隆，Kanr，Hygr 转入大肠杆菌

 里氏木霉β-葡萄糖苷酶cel1a的克隆步骤