微卫星分子标记( microsatellite) 是指以 2-6 个碱基长度的核苷酸单位以多次串 联重复排列在基因组上的一段 DNA 序列，亦称简单序列重复( simple sequencerepeats， SSR)[5]。微卫星标记与其他分子标记技术相比有以下优点: 多态性高、符合孟德尔遗传模 式、共显性遗传，易于 PCR 检测和在基因组上分布均匀等优势，因此，在种群遗传结构分 析、连锁图谱构建以及系谱认证等工作中，微卫星标记技术得到了广泛的应用。微卫星的 开发方法有富集文库法，跨种扩增法，数据库挖掘，高通量测序等[6]。Messier 等[7]指出 在进化过程中微卫星的产生机制有两种：（1）DNA 复制过程中滑动，DNA 复制时，聚合酶 从其位置上脱离，模板链和新合成链暂时分离，几秒钟后部分复性。如果这一过程发生在 重复序列复制完成，则新合成链上的重复单元可以与模板链上的重复单元错配，在某一单 链上产生一个单链环。（2）DNA 复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，如果这种错配不 能修复，不论这个环被切除或保留都将产生突变。保留导致插入突变，切除导致缺失突变。 微卫星越长，越容易发生滑移，从而造成重复单元的减少或大量增加。另外，在减数分裂 中的不等交换，导致一个或几个重复单位的插入或缺失，使这些重复序列的拷贝数发生了 变化，也是微卫星形成的主要原因。微卫星序列由中间的核心重复序列和侧翼的保守序列 组成，其多态性产生一般是由核心重复单元重复次数的改变而引起[8]。

EST-SSR 已经成为现在很重要的种群遗传分析方法了[9]，目前开发的 EST 其他分子 标记技术也很多，如 EST-AFLP,EST-RFLP,EST-PCR,EST-SNP 等。虽然 EST 是高度保守序列， 十分稳定，但多态性较低，所以由其开发的多态性标记准确性高[5]。对于多态性微卫星标

记的开发也是很多的，而对于华鳈的多态性 EST 微卫星标记还未曾有过。 本研究目的在于开发华鳈的多态性 EST 微卫星标记，以期为洪泽湖华鳈的遗传多样

性、种质评估和遗传选育提供本底资料。文献综述

2 材料与方法

2。1 华鳈 DNA 的提取

本实验采用苯酚—氯仿抽提法提取转录组DNA，参照朱传坤[10]鳙鱼DNA提取方法并进 行了改进。

1。首先用洁净的镊子取固定于无水乙醇的华鳈肌肉组织 100-200mg（约指甲盖大小）放入

2mg灭菌离心管中，用洁净的手术剪刀将其剪碎，剪碎后晾干使酒精挥发。每剪完一 个样品，剪下一个之前将镊子和剪刀在蒸馏水中漂洗，然后用酒精棉擦拭以防样品污 染。

2。接着用移液枪向离心管中加入500ul抽提液及2ul（1mg/ml）蛋白酶K（根据样品量确定 加入抽提液体积），置于55℃烘箱中消化反应4-5小时（开始进行消化的半个小时每 隔5分钟翻转样品管，使成团组织块分散），消化至样品管内看不到组织碎块完全成 为液体。3。然后将消化好的样品室温下放置冷却至室温。向离心管中加入250ml的平 衡酚（PH=8。0）和250ml氯仿，手工上下翻转样品15-20min，混匀管内容物使之成为 乳浊液。第一次加入平衡酚时翻转样品管1小时以上蛋白抽提效果较好，更容易转移 上清液。将混匀后的离心管置于冷冻离心机中4℃以下10000rpm离心10min，使有机相 与水相充分分离。

4。用剪好的钝枪头轻轻吸取上清液，转移至新的无菌离心管中，弃去两相界面的蛋白质和 下层有机相。再加入与离心管内上清液等体积的平衡酚和氯仿，手工上下翻转

15-20min。接着置于冷冻离心机中离心。

5。离心后取上清液于新离心管，再加入等体积的氯仿异戊醇混合液，手工上下翻转