怀菊花活性成分及抑菌作用研究(3)
提取率（mg/g）=C0VK×10-3/W
式中：C0-测量液多糖的浓度（µg/mL）；V-粗提取液体积（mL）；K-为稀释倍数；W-原料干重（g）。
1.3怀菊花黄酮的提取及含量测定[9-10]
1.3.1总黄酮标准曲线的绘制
可见分光光度法是较常用被一些药典所广泛采用的的总黄酮测定方法，此方法使用NaNO2-Al(NO3)3作为显色剂，利用与黄酮类化合物生成的红色物质为特征，测定其在510 nm波长处的吸光度，并以芦丁作为标准品，计算待测物质中的总黄酮含量。
吸取0、1、2、3、4、5 mL的芦丁标准溶液，分别置于试管中，各加30%的乙醇使成5 mL，分别加入0.3 mL 的5% NaNO2溶液，摇匀，放置6 min左右，加入0.3 mL 的10% Al(NO3)3溶液，摇匀，放置6 min，加入4 mL的 4% NaOH溶液，加蒸馏水定容至10 mL，静置15-20 min左右，于510 nm波长处测定其吸光度。做三次重复，取平均值（表2），绘制标准曲线（图2）。求得回归方程：y = 13.257x-3.1×10-3 R2 = 0.9998。
表2 芦丁浓度C与吸光度A的关系
A 0 0.129 0.259 0.390 0.532 0.660
C(mg/mL） 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
图2 总黄酮含量测定的标准曲线
1.3.2怀菊花总黄酮的提取
称取怀菊花4份，每份2 g，在室温下分别加入50 mL的蒸馏水、75%甲醇、75%乙醇、75%丙酮做提取剂，在微波功率中高火下提取2 min，抽滤，药渣重复以上步骤合并滤液，用提取液定容至100 mL备用。
1.3.2怀菊花总黄酮含量提取率的测定
取1 mL的稀释样品液于试管中，各加入4 mL 的30%乙醇使总体积至5 mL，分别加入0.3 mL的 5% NaNO2溶液，摇匀，放置6 min，然后加入0.3 mL的 10% Al(NO3)3溶液，摇匀，放置6 min左右，加入4 mL的 4% NaOH溶液，加蒸馏水定容到10 mL，静置15-20 min左右，在510 nm波长处测定吸光度。由回归方程计算得出测量液中总黄酮的浓度C（mg/mL），按照下列公式计算提取物总黄酮的含量（mg/g）。
提取率（mg/g）＝CVN/W
式中：C－测量液总黄酮浓度（mg/mL）；V－粗提液体积（mL）；N－稀释倍数；W－原料干重（g）。
1.4怀菊花提取液的抑菌活性[11-14]
1.4.1培养基的制备
大肠杆菌培养基：牛肉膏2.5 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 2.5 g，琼脂8.5 g，500 mL蒸馏水，PH7.0-7.2，121℃灭菌30 min。
农杆菌培养基：蛋白胨5.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母浸粉1.0 g，蔗糖5.0 g，MgSO4•7H2O 4.0 g，琼脂15.0 g，PH7.2-7.6，121 ℃灭菌30 min。
1.4.2活化菌种
在无菌工作台上把低温保存的菌种用移液管吸取一定量的放入灭菌好的液体培养基里，把锥形瓶放在恒温摇床上过夜增殖。过夜增殖菌种时，恒温摇床要在设定一定的范围内，增殖大肠杆菌时恒温摇床的转速设定为180 r/min，温度为37 ℃。增殖农杆菌时，恒温摇床的转速调为180 r/min，温度设定为28 ℃。
1.4.3抑菌液的制备
取适量的怀牛膝茎叶多糖和蒸馏水放于小烧杯中，于紫外灯光下灭菌40 min。然后取滤纸片在上述溶液中浸泡一定时间。
1.4.4实验操作
将灭菌的培养基倒入无菌培养皿中，水平放置使凝固。用无菌吸管移取0.3 -0.5 mL的菌悬液加入到已凝固的培养基上，用无菌三角涂布棒涂布至均匀。将涂布好的培养皿分成3等分，作上标记（在培养皿的下面用记号笔做标记）。用无菌镊子将已灭过菌的圆滤纸片置于每个培养皿相对应的位置，其中一个为无菌水对照，另外两个为不同方法提取的多糖浸提液。每个菌种做四个重复，和一个空白对照。将带有大肠杆菌、农杆菌的培养皿放于分别置于37℃、28 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察产生抑菌圈的情况，并测量抑菌圈的直径。
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