1。10数据分析 12

2 结果与分析 12

2。1 PsHsp70的序列特征 12

2。2 重组hsp70的纯化与其ATP酶活性测定 12

2。3 PsHsp70在甲鱼中的表达 13

2。3。1 PsHsp70在甲鱼不同组织中的特异性表达 13

2。3。2不同孵化温度对PsHsp70表达的影响 13

2。3。3 细菌感染对PsHsp70表达的影响 13

3 讨论 14

参考文献 15

致谢 17

引言

甲鱼，学名为鳖，具有很高的食用价值和药用价值。甲鱼滋味肥厚，营养丰富，含人体所需的蛋白质和脂肪，同时含有钙、铁、锌、磷、维生素A、维生素B、维生素E、烟酸等微量元素，其保健因子富集在甲鱼体内，具有营养保健、滋阴壮阳及抗癌抗衰老等功能。食用甲鱼属高档滋补食品，是水产之珍品，高档酒宴之佳肴，深受人们的欢迎和喜爱。论文网

众所周知，随着野生甲鱼生存环境的恶化和人类的过度捕捞，野生甲鱼的数量越来越少，价格也越来越高。同时甲鱼在人工养殖中经常出现大量死亡现象，因气候不稳定，生活环境差，水质不好，养殖方法不当等原因常会感染革兰氏阴性菌而引起甲鱼疾病大爆发。本次实验所选用的感染致病菌是水体中常出现的细菌——嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilia)[1]，其在现代高密度养殖和加温(28-30℃)饲养条件下，繁殖能力最佳，致病性增强，是导致鳖病的主要致病菌[2]。甲鱼嗜水气单胞菌感染的临床病型有多种，例如局部感染为主的皮肤溃疡、疖疮病，红脖子病，以及全身感染的红底板病、白底板病、白点病、穿孔病、肠炎病等，而最为常见且危害又极严重的是急性出血性败血症[2]。一旦甲鱼患病再用药，只能控制病情蔓延，只能治愈病情较轻的甲鱼，而对病情重的甲鱼基本无作用。因此，分析甲鱼患病原因并采取有效防治措施显得尤为重要。经研究，食用甲鱼的免疫力甚至其生存都受到了孵化温度的影响[3]。如同其他变温动物一样，食用甲鱼的体温受到环境温度的影响，导致生理学生化反应速率以及生物分子的稳定性发生改变[4-9]。依据2013年的IPCC报告数据可知，全球气候变暖是一个大的趋势，环境温度影响着变温动物的生长孵育和繁衍，所以我们的研究焦点将集中在热适应的内在机制上。可控的实验室生理学研究表明，热激蛋白与气候变暖和动物的生存有着密切的联系[10-12]。

热激蛋白70，又称热休克蛋白70（heat shock protein70,HSP70），首次在果蝇中发现并报道，是一种结构上高度保守的多肽，与植物和动物的温度波动有密切的关系，是生物适应环境中温度变化的重要因子。结构上来讲，热激蛋白70包含一个ATP结合结构域，一个底物结合结构域和一个C末端结构域，它的功能基于底物的结合与释放，通过识别热激元件调节热激蛋白70的表达。热激蛋白70可分为组成型表达的Hsc70（Heat shock cognate70，p73）和对压力响应的诱导型Hsp70（Heat shock protein70，p72），两者的氨基酸序列90%是相同的，生化特性基本相同（电泳泳动度稍有差异）[13]。为满足实验需要，在本文中，我们将对甲鱼诱导型热激蛋白70的克隆和表达进行详尽描述。

作为一个生物标记物质，热激蛋白70同其他热激蛋白家族的成员一样可以对周围环境作出反应，不仅在温度的变化上，而且能对诸如重金属感染、无机物污染等刺激作出反应[14]。热激蛋白70在进化过程中异常保守，起到了压力感应标记物和分子伴侣的作用，在有害的环境中保护细胞免受伤害，在极端环境中被诱导的热激蛋白70可以保护细胞，参与从蛋白跨膜转运到凋亡的调控。[15]。最近的研究表明，热激蛋白70同人类的天然免疫也密切相关[16-19]，热激蛋白70主要通过增加组织相容性复合物因子的稳定和表达来参与抗原的加工与递呈[20]。因此热激蛋白70可作为临床指标，在癌症细胞中，热激蛋白70作为分子伴侣的相关肿瘤多肽，可能会使抗肿瘤T细胞免疫功能得到活化，应用于癌症的治疗，甚至可能开发成为抗肿瘤疫苗[21-22]。随着生物技术与医药技术的进一步发展，Hsp70在食用甲鱼等动物及人类的疾病防治中会不断进步与发展，并将拥有光明的前景和更多的应用。本文主要研究适用于甲鱼的热激蛋白70，通过组织特异性表达，孵化温度，细菌感染等条件，找到增强食用甲鱼免疫能力的方法。