1。3  实验室前期研究基础

本课题组在前期的工作中，在充分研究β-榄香烯高产植株温郁金体内合成β-榄香烯的生物合成途径的基础上，以大肠杆菌作为宿主，将MVA途径上的7个关键酶基因以及蓝细菌吉马烯A合酶(Germacrene A Synthase)基因导入，在大肠杆菌细胞中成功构建了β-榄香烯的前体吉马烯A(Germacrene A)（高温下可自动转化成β-榄香烯）的体外生物合成途径，GC-MS成功检测到了产物Germacrene A，最高产量达到128μg/L，虽然产量较初始值有了很大的提高，但要达到工业应用水平还有相当大的差距。采用合成生物技术获得高产β-榄香烯的工程菌株的关键是具有高效催化效率的生物酶，这是本课题的研究重点。

图1-1

1。4  定点突变

PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

预先设计长度通常为30个碱基以上的互补的两个引物，在引物中含有预期所需突变位点。以待突变的质粒为模板，用上述设计的两个引物进行PCR扩增反应。这样可以得到含有预期的突变位点的双链质粒，但这个双链质粒中有两个nick位点。待突变的质粒通常来源于大肠杆菌等细菌，在细菌中一般会被甲基化修饰，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用甲基化酶Dpn I处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。这样把Dpn I处理过的产物转化细菌后，质粒中有两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。论文网

李振秋[9]对紫穗槐二烯合酶RｘR基序的262位氨基酸Arg突变为Leu及相关的D300位点进行了定点突变，发现保守基序中的R262K单点突变后其酶促反应主产物为(3R)-(E) -nerolidol（橙花叔醇），结果显示D300突变结果显示保守基序中第一个Arg对酶的活性维持非常必要。R262突变体的主产物nerolidol（橙花叔醇）可由紫穗槐二烯生物合成途径中碳正离子中间产物被水分子淬灭而生成，突变后的赖氨酸侧链要比精氨酸短，因此可以推测R262K突变使得活性中心口袋封闭性发生变化，在此位置水分子容易接触到碳正离子，从而提前中断紫穗槐二烯的合成，生成nerolidol（橙花叔醇）。

王波[10]对紫穗槐二烯合酶RｘR基序的439位氨基酸Gly分别突变为Ala，Ser，Cys和Val。最终结果显示，G439位置的突变对酶的活性和最终催化的产物的比例都有一定的影响，其中G439A和G439S的突变，导致主产物的含量比例降低，而某些副产物的比例提高；G439C的突变导致酶的活性大大下降，只能检测到微量的产物；G439V的突变导致酶的催化活性完全消失。从ADS的三维结构上看，G439位于活性区域，靠近底物且朝向空腔内部，从A-S-C-V的逐步突变，导致氨基酸侧链逐渐增大，使得活性中心空腔的体积缩小，从而影响催化活性。

金亚明[11]对紫穗槐二烯合酶(ADS) RｘR基序的439位氨基酸Gly突变为Cys，结果显示酶经过突变的酶失去了催化紫穗槐二烯合酶的活性，得到了催化底物产生红没药烯（β-Bisabolene）的新活性。通过倍半萜合酶催化示意图分析，在未突变紫穗槐二烯合酶的催化过程中，紫穗槐二烯的合成有 2 次成环作用，首先是 1 号碳与 6 号碳成环，在活跃的碳正离子迁移下，1 号碳与10 号碳形成第二个环，最终形成紫穗槐二烯，经过突变的 紫穗槐二烯合酶，反应在第一次成环以后终止，可能的原因是突变引入的半胱氨酸的侧链带有巯基，巯基的偶极作用稳定了碳正离子，使碳正离子不再迁移，导致第二个环没有形成，而新的产物红没药烯形成。详细对比已知三级结构的合酶与紫穗槐二烯合酶的不同，在活性中心附近寻找差异残基进行突变，将为解决萜类合酶的催化机制提供新的证据。