［摘要］目的探究抑转丸对Lewis肺癌瘤株转染的C57BL/6小鼠黏附分子CD44V6表达的影响,从而揭示其抗转移机制。方法将40只小鼠随机分为4组:B。C。D组均造模,造模24h后C。D组分别以抑转丸小剂量。大剂量悬液灌胃,第21天处死小鼠,检测各项指标。结果C。D组出瘤时间显著延长(P<0论文网。01);大。小剂量抑转丸均有对Lewis肺癌生长的抑制作用(P<0。05);大。小剂量抑转丸均可抑制Lewis肺癌自发转移及降低对C57BL/6小鼠CD44V6的表达(P<0。05)。结论抑转丸能显著抑制Lewis肺癌的生长与转移,其抗Lewis肺癌转移机制可能与降低CD44V6的表达有关。

［关键字］抑转丸;Lewis肺癌;CD44V6;益气活血

抑转丸是根据导师陈光伟主任医师在长期的肿瘤临床工作中,理论联系实际,不断总结得出益气活血为法治疗恶性肿瘤转移复发的经验方基础上研制而成的中药复方制剂。该药由西洋参。莪术。山楂。仙鹤草。鳖甲等中药组成,具有益气活血之功。为探讨抑转丸抑制肿瘤转移复发机制,进一步为临床应用提供理论依据。

1材料与方法

1。1材料瘤株:Lewis肺癌;实验动物:C57BL/6小鼠(18~22g)40只(第四军医大学提供)。

1。2主要药品及试剂抑转丸(YZP)由青岛市黄岛区中医院制剂中心提供。YZP配制:大剂量按小鼠36g/kg(相当于临床用量的3倍),小剂量按小鼠12g/kg(相当于临床用量)用生理盐水分别配制成3。6g/ml和1。2g/ml混悬液;兔抗小鼠CD44V6单克隆抗体(BA0454),兔抗小鼠CD4单克隆抗体(BA0430),S-P试剂盒(武汉博士德生物工程公司);Buin’s液(自配)。

1。3主要仪器解剖显微镜(日产Olympus)。电子天平(上海第二分析仪器厂)。超净工作台(guard型,德国)。水平离心机(LD4-2型,北京医用离心机厂)。γ计数器(MH-01型,中创集团北京民华科技公司研制,中国同位素公司监制)。

1。4方法

1。4。1模型复制［1］将肺癌荷瘤小鼠脱颈处死,放入75％酒精中浸泡10min,在超净工作台上分离瘤体,取其中生长良好。无坏死的肿瘤组织,用生理盐水冲洗后剪碎,经0。25百分号胰蛋白酶室温下消化5min,用组织匀浆器研磨肿瘤组织制成匀浆过300目尼龙网制成单细胞悬液,用生理盐水调整细胞浓度至1×107/ml,0。2百分号台盼蓝染色,在倒置显微镜下计算活细胞数,即未染色的细胞数>95％,在每只小鼠右腋皮下接种瘤细胞悬液0。2ml。

1。4。2分组接种瘤组织前把40只小鼠随机分成4组:空白对照组(A组),荷瘤对照组(B组),抑转丸小剂量组(C组),抑转丸大剂量组(D组)。4组动物分笼喂养。适应性喂养1周后,B。C。D组接种瘤细胞悬液,并于24h后开始灌胃给药:A。B组用生理盐水0。2ml/(只·d),C。D组分别用浓度为1。2g/ml。3。6g/ml的抑转丸混悬液0。2ml/(只·d),共灌胃21天。

2检测项目与方法

2。1测移植瘤重,计算抑瘤率处死动物后,剥离移植瘤体,电子天平称重,计算抑瘤率;石蜡包埋,连续切片,厚度约4μm。抑瘤率(百分号)＝(对照组瘤重－用药组瘤重)／对照组瘤重×100％。

2。2观察肺转移数,计算肺转移抑制率方法同上,取血后颈椎脱臼处死小鼠,剥离小鼠肺脏,用电子天平称重,Buin’s液固定,并计算肺转移结节数,计算肺转移抑制率。

2。3CD44V6检测

2。3。1检测方法［2］用S－P法,将石蜡切片脱蜡至水化,3百分号过氧化氢室温孵育10min,消除内源性过氧化物酶的活性,蒸馏水冲洗3次,每次2min,PBS液浸泡5min,将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液的容器中加热,使容器内液体温度保持在92℃~98℃,并持续15min,10百分号正常血清(PBS液稀释)封闭,室温孵育10min,倾去血清,滴加1∶75的CD44V6抗体4℃冰箱过夜,PBS冲洗3次,每次5min,滴加生物素标记的二抗工作液,37℃湿盒中孵育30min,PBS冲洗3次,每次5min,滴加适量辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液,37℃湿盒中孵育30min,PBS冲洗3次,每次15min,DBA显色剂显色,显微镜下观察10min,适时终止反应,自来水冲洗,苏木素复染,脱水透明,中性树脂胶封闭。

2。3。2对照阴性对照以PBS取代一抗,阳性对照为已知的阳性片。

2。3。3CD44V6结果测定［3,4］以细胞膜呈棕黄色为阳性,随机计数5个视野,根据阳性细胞所占比例分为阴性(－):即阳性细胞数<5％;阳性(＋):即阳性细胞数≥5％。

2。4统计学方法试验结果数据均用均数±标准差(x±s)表示,统计学处理分别用χ2检验和t检验。

3结果

用药后观察小鼠一般情况,4组小鼠移植瘤均存活并生长,用药过程中各组小鼠活动正常,反应灵活,无毛色枯槁。腹泻。消瘦等,空白组与荷瘤组各1只小鼠在灌胃过程中死亡,尸检为液体灌入气管窒息所致。

3。1各组出瘤时间比较见表1。C组和D组的出瘤时间分别与B组比较差异均具有非常非常显著性(P<0。01),C组与D组的出瘤时间比较差异无显著性(P>0。05)。表明:大。小剂量YZP组与荷瘤对照组相比较均能明显延长C57BL／6小鼠的出瘤时间,大剂量YZP与小剂量YZP延缓出瘤时间的作用无差异。表1各组出瘤时间的比较注:C组。D组与B组对比,星号P<0。01;D组与C组对比,△P>0。05

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