将POM/PLLA纤维浸入浓度为60mg/mL的己二胺异丙醇溶液,在40℃条件下,缓慢搅拌,氨解反应12小时。当反应结束时,用异丙醇与蒸馏水反复冲洗数次,除去未反应的己二胺。氨解的纤维样品真空干燥,用于脂肪酶的负载。 

2。3  脂肪酶在POM/PLLA-NH2表面固定化

取一定量的脂肪酶放入10mL NHS溶液(5mM)的磷酸缓冲溶液(0。05M, pH=5。5)中4℃ 震荡水浴进行活化2h,取4 mg 己二胺改性后的POM/PLLA纤维膜,用去离子水和PBS缓冲溶液(0。05M, pH=5。5)冲洗后加入上述溶液中,随后加入10mL EDC·HCl (50mM)溶液;将上述混合反应液放入4℃的恒温振动水浴中反应12h,反应结束后,用0。05M, pH=5。5磷酸缓冲溶液反复洗涤固体化酶,用来除去未反应的脂肪酶以及杂质,最后冷冻干燥用于后续酶活性以及稳定性测定;收集结束后的溶液和PBS冲洗液用来测定未固定化酶的含量。

2。4  结构与性能表征

(1) 结构表征

采用Bruker Vertex 70v傅立叶变换红外光谱仪(美国)对酶固定化前后的薄膜载体结构进行表面衰减全反射光谱(ATR-FT-IR)表征;

利用HITACHI S4800 扫描电镜(日本)在30kV操作电压下观察POM/PLLA纤维膜的形态;

利用激光共聚焦显微镜(Nikon-A1 system,日本)观察固定化酶的形态,用于激光共聚焦显微镜观察的脂肪酶需要采用异硫氰基荧光素(FITC)进行标记,方法如下:向20mL脂肪酶溶液中加入0。1mL的FITC,在4℃下避光放置24h, 然后将酶液放置于超速离心机中以5000 rad/min离心10min除去上清液,用PBS溶解离心管中的脂肪酶,再次进行离心,连续三次。最后用PBS溶解经FITC标记的脂肪酶,按步骤2。3将其固定于纤维膜上,用于激光共聚焦显微镜观察。论文网

   利用HITACHI HT-7700(日本)透射电子显微镜在100kV工作电压下观察POM/PLLA纤维胺解反应前后的形貌。

   利用Thermal Scientific ESCALAB 250Xi(美国)X-射线电子能谱仪对纤维表面元素进行分析。

利用Kruss,DSA-100(德国)液滴形状分析仪对纤维表面的亲疏水性进行分析。具体如下,将样品用双面胶贴在载玻片上,将体积为5μL的水滴滴在膜表面,用摄像机实时拍摄液滴曲面,然后经电脑拟合Young-Laplace方程计算得出样品的静态接触角,同一样品重复5次,确保实验误差。测试液体为超纯水。

(2) 载酶量和固定化效率

图2。1 测定样品蛋白质浓度的标准曲线

采用Bradford[7]法测定步骤2。3中悬浮溶液中的酶蛋白含量,操作方法如下所示:用BSA配成1mL中含蛋白质20μg、40μg、60μg、80μg、100μg 的一系列标准液,并在上述各管各加考马斯亮G-蓝250溶液5。0mL,5分钟后,采用Shimadzu UV-2450(日本)可见分光光度计在不同样品在595nm波长处吸光度,以蛋白质含量为纵坐标,以吸光度为横坐标,绘制标准曲线,如图2。1所示。

用上述方法检测固定化前后的酶溶液,以及清洗固定化酶膜所用的PBS中蛋白含量,根据公式(1。1)计算固定化效率(Immobilization Efficiency,IE):

IE(%)=     (式1。1)

式中:C0为固定化之前酶溶液中蛋白浓度 (mg/mL);C为固定化反应之后酶溶液中蛋白浓度(mg/mL);V 是固定化酶实验中所用的酶溶液的体积(mL);Cw是冲洗固定酶膜所用的PBS缓冲溶液中的蛋白含量(mg/mL);Vw是冲洗固定化酶膜所用的PBS缓冲溶液的体积(mL)。

相同条件下的实验重复三次以上,取平均值,保证实验误差在5%左右。

(3)固定化酶活性测定[8]

底物橄榄油乳化液中加入脂肪酶后,可以将底物水解为脂肪酸和甘油,使用标准碱溶液结合指示剂可以产物脂肪酸的量进行滴定,由耗碱量可求出脂肪酶的活性。一个脂肪酶的活性单位(U)对应于在检测条件下,每小时内从橄榄油中水解1μmol脂肪酸所需要的酶量。具体实验步骤如下:

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