1。4消毒条件研究进展

分离药用植物内生真菌的最初步骤为表面消毒，灭菌条件将影响分离出内生真菌的结果。有研究者对表面消毒剂的选择、表面消毒的处理时间、样品尺寸大小进行了比较，探究了对植物内生真菌分离频率的影响[17]。因而在做分离实验时，尽量能够考虑这些影响因素，以便能够确定最佳消毒条件来分离植物组织内生真菌。

对药用植物进行表面消毒处理，通常选择强氧化剂或者一般消毒剂处理一定时间，最后用无菌水漂洗植株表面残留的消毒剂，其中用于表面消毒最常见的试剂为次氯酸钠、升汞、高锰酸钾、乙醇等。而通常会选择乙醇与其他消毒剂共同配合，因乙醇在处理植株时，既有除湿剂的功效又有消毒剂的功效[18]。由于升汞的毒性较大，并且对环境有一定的破坏作用，因而近年来使用较为少，在国内，常使用次氯酸钠作为植物组织表面消毒剂，并且配合75 %乙醇使用。次氯酸钠与乙醇具有较好的挥发性，毒性小，即便有部分残留于植株中，也会在培养过程中挥发。

有研究者曾对分离金钱松内生真菌的最佳方法以及适宜培养条件进行研究，其采用75 %乙醇、次氯酸钠溶液和无菌水洗涤工艺对植物进行表面灭菌，按照灭菌强度逐步递减的方式确定了最佳分离内生真菌的灭菌强度。李晓红等研究比较了不同的表面消毒方法对真菌分离的影响，结果表明用次氯酸钠消毒处理植株，真菌分离率更高[19]。姜国银等通过实验比较了五种不同种类的消毒剂对植株消毒效果，结果表明用75 %乙醇溶液消毒1~2 min，4 %或6 %次氯酸钠处理0。5~2 min都能从植株中获得较多内生真菌[20]。

同时，为了检验消毒方案的有效性，会设置对照实验对植物组织表面的消毒效果进行一个检查。检查方法有：组织印迹法、漂洗液检验法、组织浸渍法[21]。组织印迹法为将消毒处理过的植物组织印迹于培养基上，在相同培养条件下培养一段时间，观察培养基上是否有菌落。漂洗液检验法为将最后漂洗植物组织的漂洗液涂布于培养基上，培养观察结果，组织浸渍法为将消毒处理过的植物组织浸渍在液体培养基中，若三种方法均最终检测是否有微生物生长，若没有，则表明消毒彻底。

2 实验材料与方法

2。1实验材料

2。1。1 实验植株

用于分离植物内生真菌的飞蓬草植株采自于杭州师范大学下沙校区校园，进行全植株采样后，立即用保鲜袋装好带回实验室，在24 h内进行样品处理。

2。1。2培养基文献综述

PDB培养液（马铃薯葡萄糖培养液）：称取马铃薯100 g切成小块，煮沸30 min。冷却至室温后用8层纱布过滤，滤液加入葡萄糖10 g，搅拌均匀后再加水补充至500 mL，pH为自然，于121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。

PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）：每500 mL PDB培养液灭菌前中加入10 g琼脂粉，pH为自然，于121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。

PDA双抗培养基（马铃薯葡萄糖琼脂双抗培养基）：PDA培养基灭菌后，待温度冷却至35 ℃，于超净台中加入氨苄青霉素和链霉素，使氨苄青霉素和链霉素浓度各达到0。2 mg / mL。

WA双抗培养基（水琼脂双抗培养基）：称取琼脂10 g，用蒸馏水补充至500 mL，于121 ℃高压蒸汽灭菌30 min，待温度冷却至35 ℃，于超净台中加入氨苄青霉素和链霉素，使氨苄青霉素和链霉素浓度各达到0。2 mg / mL。

改良马丁双抗培养基：配方见表1，用蒸馏水补充至1000 mL，于121 ℃高压蒸汽灭菌30 min，待温度冷却至50 ℃，于超净台中加入氨苄青霉素和链霉素各2 g