蛋氨酸（Methionine，Met）又名甲硫氨酸，化学名为2-氨基-4-甲硫基丁酸，是一种必须氨基酸，在维持哺乳动物机体生长发育中发生作用。在细胞体内，蛋氨酸主要参与蛋白质合成。此外，蛋氨酸还是谷胱甘肽和半胱氨酸（Cysteine，Cys）、亚精胺、牛磺酸和硫化氢等体内多种活性物质的前体[2]。蛋氨酸在体内可转化成胱氨酸，具有保肝解毒的作用。在体内可提供甲基，从而预防脂肪肝的发生。Met必需由膳食中获得，无法用机体自身合成，因此膳食蛋氨酸摄入水平对机体功能具有广泛的影响。近来，有实验研究显示，在膳食中限制蛋氨酸的含量对寿命的延长可能具有积极的影响。研究数据表明，不限制食物的摄入量的情况下，在动物饲料中去除半胱氨酸的同时将蛋氨酸含量减少（从对照组的0。86%（重量比）调整为0。17%），可使雄性 Fischer 344 大鼠的寿命延长30%[3]。随后，在包括酵母、果蝇、线虫和小鼠等多种模式生物中均膳食蛋氨酸限制寿命延长的作用被一一证实[4]。

一项小规模临床试验显示，对肥胖合并代谢综合症人群进行为期12周的蛋氨酸限制干预后，机体胰岛素敏感性增强，脂肪酸-氧化增加，同时肝脏内脂肪含量有所下降[5]。研究显示，蛋氨酸限制对衰老的相关代谢变化有广泛的影响，其中包括促进能量消耗，抑制体脂沉积，降低胆固醇含量及血液甘油三酯，增强胰岛素敏感性，改善系统炎症等作用；研究还显示蛋氨酸限制可以抑制糖尿病、脂肪肝以及肿瘤等衰老相关疾病的发生发展。然而，蛋氨酸限制如何影响脂质代谢，特别是对脂肪组织脂类代谢的影响尚不清楚。

自噬(autophagy)是指细胞通过溶酶体循环利用废弃细胞成分，清除损伤细胞器和蛋白聚合物的自我消化、自我降解过程，维持细胞更新和稳态的关键细胞机制,直接或间接参与衰老以及与衰老相关疾病的各种生理和病理过程[6]。而衰老是随时间推移逐渐出现细胞修复机制发生障碍, 导致受到损伤的分子、细胞大量发生堆积, 并伴随着功能性障碍。细胞损伤累积也是包括神经退行性疾病、II型糖尿病、心血管疾病和肿瘤等多种衰老相关疾病的共同发病机制[7]。衰老往往伴随自噬活性不足,而许多老年病受累组织也存在自噬功能异常[8]。我们初步数据显示蛋氨酸限制可以诱导肝脏自噬，但对于脂肪组织细胞自噬的影响尚不清楚。另一方面，自噬还参与脂质代谢，在调节脂肪组织内脂质生成、沉积和降解可能具有重要意义。因此，本研究将分析膳食蛋氨酸限制对脂肪组织自噬相关基因(组织蛋白酶B(CTSB)、溶酶体膜蛋白LAMP1、多聚泛素结合蛋白SQSTM1和转录因子TFEB）mRNA表达的影响。

2 材料与方法

2。1 主要试剂

TRNzol-A+ 总RNA提取试剂（Cat#DP421 100ml Lot#P4511，Invitrogen 公司生产，美国）；氯仿（上海沃凯生物技术有限公司）、异丙醇(上海沃凯生物技术有限公司)；DEPC水（生工生物工程股份有限公司）；引物（为生工生物工程股份有限公司生产，中国上海）；FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（TIANGEN）、SuperReal 荧光定量预混试剂盒（TIANGEN）；CCK-8试剂盒（碧云天）；RT-PCR试剂盒；EB替代物；琼脂糖

2。2 主要仪器

洁净工作台；常温和低温高速离心机（0412-1，上海手术器械厂）；匀浆仪；海尔冰箱；核酸蛋白测定仪；移液枪；梯度热循环仪（LongGen）；96孔照明板器（美国Thermo scientific）；液氮罐；PCR测定仪（美国Thermo scientific）；刀片；小镊子；EP管架

2。3方法

2。3。1 实验样品来源

将6-8周龄C57BL/6小鼠分为两组（每组各8只）：1）对照组，给予正常浓度0。85%蛋氨酸饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司，TP0035S），2）膳食蛋氨酸限制组，给予0。17%蛋氨酸限制饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司，TP0035）。对照饲料和蛋氨酸限制饲料均为纯化型无胱氨酸饲料，饲料除蛋氨酸含量分别为0。85%和0。17%外，其他成分相同。小鼠均在适宜的温度与湿度下喂养一定的饲料和水，每周对小鼠的体重变化进行记录。在给予实验饲料12周后，在处死提取小鼠组织前，对小鼠进行为期12个小时的禁食，用颈椎脱臼法处死小鼠，收集附睾脂肪组织，并分别做好标记，将组织放于消毒过的锡箔纸中-70℃保存，待用于实验。来自优Y尔L论W文Q网wWw.YouERw.com 加QQ7520~18766