摘要帕金森病（PD）是一种常见与年龄密切相关的神经退行性疾病。富亮氨酸激酶2（LRRK2）上的基因突变被认为是PD的常见遗传致病原因，LRRK2蛋白质的正常生理功能及其突变体致病机理至今仍然不明。LRRK2蛋白质拥有两个重要的具有生物化学功能的结构域：Roc结构域和Kinase（激酶）结构域。PD常见相关致病突变R1441C/G/H和G2019S分别位于以上两个结构域，最终导致LRRK2蛋白质激酶活性的提高。相关研究曾报道LRRK2蛋白质Roc结构域或许是比Kinase结构域更合适的药物研发靶点。本课题研究主要以Roc结构域作为研究对象，通过构建Roc结构域及其突变体（包括致病突变体及与其GTP酶活性相关的突变体）重组蛋白表达载体，在大肠杆菌蛋白表达系统中诱导表达出稳定的蛋白质，为后续Roc结构域生物化学功能研究以及蛋白分子结构解析提供高质量蛋白样品，为深入理解LRRK2蛋白质的水解机制提供分子水平理论。 78129

关键词 帕金森病  LRRK2蛋白质  Roc结构域  蛋白质纯化

毕业论文设计说明书外文摘要

Title    The structural biology analysis of mutants of  PD-related pathogenic LRRK2 protein’s Roc domain                                                 

Abstract Parkinson disease (PD) is one of most common age related neurol degenerative disease。 Pathogenic mutations in the leucine rich repeat protein kinase 2 (LRRK2)  are usually recognized as the common causes of PD。 LRRK2, a large multi-domains protein, consists of two critical biochemical functional domains: Roc domain and Kinase domain in which the familiar pathogenic mutations R1441C/G/H and G2019S are located, as well as other protein-protein interaction domains。 Most of pathogenic mutations lead to enhancement of Kinase activity。 Some researchers have reported that Roc domain may be a regular factor of Kinase domain in LRRK2 protein, indicating that Roc domain probably is a novel potential therapeutic target of PD。 In this study, we will focus on Roc domain。 Through understanding GTP hydrolysis of Roc domain by constructing various mutants related to GTPase activity, we will further shed light on the detailed mechanism of LRRK2’s GTPase activity and the role of Roc domain in regulating LRRK2’s Kinase activity。

Keywords ： Parkinson’s disease ， LRRK2 protein ， Roc domain , GTPase activity

目   次

1  引言 1

1。1  帕金森病（PD） 1

1。2  LRRK2基因及其编码的蛋白质 2

1。3  LRRK2蛋白质的ROC结构域 3

2 ROC蛋白质表达载体构建 5

2。1实验仪器和材料 5

2。2实验方法 6

2。2。1 Roc结构域蛋白表达载体构建 6

2。2。2定点突变PCR 6

2。2。3质粒扩增及提取 7

2。2。4 DNA测序 8

2。3实验结果 8

3 蛋白质小量诱导表达测试 11

3。1实验仪器和材料 11

3。2实验方法 11

3。3实验结果 12

4 蛋白质分离纯化 14

4。1实验仪器和材料