1。10．酶的分离纯化方法

1。10。1．酶的分离、提取

分离纯化方法的分类:为了制备不同剂塑的酶制剂，需要选用合适的分离、纯化方法。即如何高效率、高纯度、高质量的从微生物的发酵液中、细胞培养液中以及动植物组织提取液中来得到所需要的产品。由于这类产品大多都是有生物活性的生物大分子物质，它们相互之间或和其它非活性物质之间的理化性质板为相似，而且生物活性常常又是不稳定的，所以要分离提纯它们，一般的传统的适用于化学物质得提纯的方法往往不奏效，需要采用一系列的基于不同原理的提纯方法、分离介质以及分离设备。酶的分离制备涉及到非常广的化学、生物学、物理学的知识，根据某一物理或者化学原理建立起的各种分离、纯化方法，主要有两方面原理。一方面，将混合物置于单相中，利用物理力场的作用，将组分分配到不同的区域，从而达到分离的目的，如超速离心，电泳和超滤。 第二种是使用组分的分布速率差异，可以分配到机械方法如盐，有机溶剂萃取，层折叠和结晶几个阶段。

1。10。2．酶的纯化、精制

（1）盐折法：此方法是目前仍然在广泛的应用的酶提纯中最早使用的方法之一，通常情况下，酶蛋白在低盐溶液中的溶解度相对较大，盐浓度增加，溶解度降低。 直接向酶蛋白溶液中加入一定量的中性盐（硫酸铵），使蛋白质絮凝沉淀。

（2）有机溶剂沉淀法：也是应用得最早且使用频繁的一种有效的纯化方法，将有机溶剂直接加入到蛋白质溶液中，使溶液电解常数降低，使电荷之间的蛋白质分子吸引力增加，然后降低蛋白质的溶解度; 另一种有机溶剂也可与水作用，使蛋白质脱水脱水。 不同蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同，有机溶剂可用于分级纯化蛋白质。

（3）吸附分离法：无机吸附剂例如氧化铝、活性炭等物质，对蛋白质有一定的吸附作用，同时也可用作酶的分离纯化，这些吸附剂对于酶或杂蛋白都具有吸附作用，因此既可用来吸附酶蛋白以除去杂质，也可吸附杂蛋白来使酶蛋白留在溶液中，有时候也可以两种方法交替的使用，以达到较好的提纯目的．吸附剂是直接除去细胞残渣等杂质，所以操作较简单。

（4）离子交换法：这是实验室使用非常广泛的一种酶的提纯方法，很多高纯度的酶都是经离子交换法得到纯化。离子交换剂是一类具有能交换带电荷物质的能力得大分子物质，多孔或网状结构，并含有可解离(交换)基团，可以在溶液中吸附基团，以便取代交换器上的离子。有许多类型的离子交换剂。凭据解离组的解离能力，分为强酸型，弱酸型，强碱型和弱碱型四大类。凭据离子交换的性质可以分为两类，即阳离子，阴离子交换剂; 并根据离子交换剂基质的性质可分为离子交换树脂，离子交换凝胶，离子交换纤维素三大类。一些大孔性的弱酸或弱碱性树脂适合用于酶的纯化，离子交换纤维素和离子交换凝胶是近年来才发展起来的新型交换剂。由于它们具有吸附容量大、分辨力高的特点，在分离、纯化酶蛋白时，拥有更大的优越性，所以具有较广泛的应用前途。利用离子交换法分离、纯化酶蛋白时，一般需经过交换剂的预处理、吸附、洗脱和再生等过程。

离子交换过程又分静态法与柱层析法：静态法的操作比较简单便捷，它是将预处理过的交换剂直接投入到待分离的酶液中，令酶分子（或杂质)吸附到交换剂上。通过离心或过滤的手段使杂质与交换剂分开，再通过洗脱液把酶蛋白洗脱下来，如果开始吸附到的是杂质分子，那么清液中留下的则是纯化过的酶分子。