20世纪90年代以来，科学家们逐渐发现了突破衍射极限的方法，从而涌现出一些能够获 得极高分辨率的超分辨显微成像技术，包括受激发射损耗技术(Stimulated Emission Depletion, STED)[9]，结构光照明显微成像技术(Structured Illumination Microscopy, SIM)[10]，光激活定位 显微成像技术(Photoactivated Localization Microscopy, PALM)[11] 和随机光学重构显微镜 (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM)[12]。截至目前，能够实现超高分辨率 的显微成像技术还包括fPALM、SSIM、dSTORM[13]等，这些方法的原理和上述四种超分辨 成像方法大同小异。

超分辨显微成像技术既保留了光学显微成像对生物样品破坏性小、可用于活细胞成像的

优点，又从本质上突破了衍射极限、显著提高了成像分辨率，同时还可以借助荧光标记等手 段实现对生物样品内部结构的特异性观察。这吸引了更多的科学家致力于超分辨显微成像的 方法研究和实验应用，推动了超分辨成像技术的飞速发展。2014年，瑞典皇家科学院宣布将 诺贝尔化学奖授予在超分辨成像领域做出重要贡献的Eric Betzig, Stefan Hell和William Moerner[14]。这足以表明超分辨成像技术在科学研究中的重要地位。论文网

超分辨成像方法根据其成像原理可以分为两类：一类是基于单分子定位成像的超分辨显 微技术，包括PALM和STORM等；另一类是基于特殊强度分布的光场照明来实现超分辨成像， 包括STED和SIM[15]。SIM的成像原理为：通过特定的结构光照明将物体的细微结构编码到大 于衍射极限的摩尔条纹中，然后再利用相应的算法将物体解码出来，从而实现超分辨效果。 但是SIM的分辨能力有限，极限分辨率约为100nm。之后发展的SSIM可以达到50nm的分辨率， 但是需要很强的光功率，对生物样品有很大损伤[10]。STED基于荧光探针分子的受激损耗原 理用环形损耗光漂白发光区域外围的荧光分子，使其从激发态回到基态，锐化点扩散函数， 使得最终只有环形中央的荧光分子能够正常发射荧光，从而得到样品的超分辨显微图像。但 是，由于STED技术中荧光分子饱和光强非常强，需要光功率极高的环形光才能将其漂白， 这大大加重了样品的光漂白和光损伤，严重制约了STED在生物成像中的应用[16]。

基于单分子定位成像的PALM和STORM原理是一样的，我们将其统称为超分辨定位显 微成像技术[17]。但是，PALM通常使用光敏荧光蛋白来特异性标记生物样品，而STORM一般 使用的是荧光染料和免疫标记技术。这类成像技术结合了光转换荧光探针的特异性标记技术、 单分子检测技术和单分子定位算法，将光学显微镜的定位精度提升到2~25nm，这样的定位精 度意味着可以对精细的亚细胞结构进行纳米级的定位成像。

超分辨定位成像技术是以降低时间分辨率为代价来换取空间分辨率的极大提升，其技术 核心是基于光激活探针的光物理或光化学特性通过控制荧光分子的on/off状态将空间中密集 标记的荧光团在时间上分散开，从而能够依次定位所有荧光分子，成像原理如图1。3所示。首 先用光转换荧光探针标记生物样品，然后用一定波长的激活光随机激活视场内的一些荧光分 子使其由暗态(off)进入荧光态(on)。激活光需要保持很低的光功率来保证每次只有数量很少 的稀疏分布的荧光分子被激活。然后，用激发光照射样品，促使处于荧光态的分子发射荧光 光子，用相机捕获荧光信号对分子进行成像，进而用定位算法对这些分子进行定位。由于荧 光态分子的稀疏分布保证了在衍射极限区域内每次最多只有一个分子被激活，所以能够对每 一个分子进行高精度的定位，最后漂白处于荧光态的分子，使其回到暗态，这样就完成了一 次循环。之后不断重复激活-激发-定位-漂白的过程。在定位成像过程中，为了采样足够多的 分子，这样的循环需要持续上万次，最终将所有精确定位的分子合成到一幅图像上，得到生 适用于单分子定位超分辨成像系统样品池制备(3):http://www.youerw.com/wuli/lunwen_89388.html