难吸附的非蛋白质抗原 可采取间接包被法。通过使用间接包被的抗原通过固相包被板层析，来提高抗原浓度；

 亲和生物素 可先用亲和生物素来处理载体，再包被在板上，使得抗体在板上牢固，匀称；

 脂类物质 无法吸附于聚苯乙烯板上，因而需要使用有机溶剂事先溶解处理后加入包被板上，低温、通风、过夜，以达到使脂类干固在ELISA板上的目的。

 抗原 主要为天然抗原，合成抗原和抗原决定簇三类；

 抗体 与聚苯乙烯有较高亲和度，容易包被。

 缓冲液的使用 包被时多使用碳酸盐缓冲液（ph：9。6）、磷酸盐缓冲液（ph：7。8）、或者Tris-HCl缓冲液（ph：7-8），之后低温（4~8℃）过夜，然后在37℃中温育2h，之后需要使用封闭液封闭处理（注：封闭为使用大量的与实验无关的蛋白质溶液填充孔中包被蛋白之后的剩余位置，以避免之后ELISA实验步骤中干扰物质的二次吸收。）

封闭液的选择：1）浓度为10%的小牛血清，2）浓度为0。05%~0。5%的BSA，3）浓度为1%的明胶，4）脱脂奶粉，浓度可选择5%。论文网

3）洗涤液：一般为含有吐温稀释液的磷酸盐缓冲液。吐温浓度约为0。05%

4）二抗（酶标抗体，也叫结合物（conjugate））的准备

 结合物（conjugate）的准备需要考虑的因素：1）选用的酶的催化活性的高低；2）抗体/抗原的免疫活性的高低；3）游离抗体或者抗原的含量多少（越少越好）；4）结合物是否有良好的稳定性。

 二抗抗体、抗原种类的选择：一般来说选用浓度较高的IgG（免疫球蛋白），这是为了避免在进行酶联反应时受到杂蛋白的干扰。同时可以考虑层析纯化抗体，这样可以保证所有酶结合物均具有特异的免疫活性，并可以是反应在高稀释度下进行，实验结果可能会本地较低，注意不管什么种类的抗原或者抗体，都必须是高度纯化的。

 酶的选择：高度纯化，催化反应的转化率高，极强的专一性，极高的稳定性，丰富的来源，受检标准中不纯在重复的酶种类。

此外酶结合物需要保留完整的活性部位和一定的催化能力，易于制备及保存的底物，低廉的制备价格以及易于测定的有色产物等特点。

一般可供选择的酶的种类有：HRP，P，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等，其中HRP一般使用频率较高。

HRP（辣根过氧化物酶）HRP是一种分子量达44000的糖蛋白，由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合而成，中性糖和氨基糖约占18%，主要有甘露糖、木糖、阿拉伯糖和己糖胺等。每一个HRP分子中含一个氯化血红素IX作辅基，该辅基在403nm波长处有最大吸收峰，而去辅基的酶蛋白在275nm波长处有最大吸收。HRP在403nm的OD值与275nm的OD值之比，也就是所谓的RZ（辣根过氧化物偶联值）值。RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，并非表示HRP制剂的真正纯度，而且RZ值高的HRP制剂，并不意味着酶活性也高。

纯HRP干燥贮存于-20℃可保持稳定，使用1。36 mol/L甘油、10mmol/L磷酸钠、30umol/L牛血清白蛋白和20umol/L细胞色素C（pH 7。4）溶液作为基质冷冻保存，可使酶结合物稳定数年。

氰化物或硫化物在10-5～10-6mol/L浓度时具有可逆性地抑制HRP的作用；氟化物、叠氮化合物或羟胺仅在高于10-3mol/L浓度时抑制HRP；HRP还可被羟甲基过氧化氢不可逆地抑制。强酸也是HRP的强烈的抑制剂。因此，在酶免疫测定常选用上述的某些化合物如氟化钠、叠氮钠和强酸等作为酶反应的终止剂。

根据HRP的催化特性，ELISA中一般使用过氧化氢（H2O2）作为HRP底物之一，在供氢体（即色原底物）存在时，HRP与H2O2的反应迅速而又专一。 ELISA实验国内外研究现状(2):http://www.youerw.com/yanjiu/lunwen_94427.html