2。2。3  Trans-5α感受态细胞转化 12

2。2。4  Trans-5α感受态细胞转化后提取质粒 13

2。2。5  BL21感受态细胞转化 13

2。2。6  蛋白凝胶电泳 13

2。2。7  突变体催化产物分析 15

3  结果与讨论 17

3。1  提取质粒 17

3。2  突变PCR 17

3。3  Trans-5α感受态细胞转化 18

3。4  Trans-5α感受态细胞转化后提取质粒 18

3。5  BL21感受态细胞转化 19

3。6  蛋白凝胶电泳 20

3。7  突变体催化产物分析 21

4  总结与展望 24

参考文献 26

致谢 28

1  引言

1。1  温郁金及β-榄香烯简介

温郁金Curcuma wenyujin 为姜科植物，是浙江省道地药材“浙八味”之一，温莪术是温郁金的根茎，呈长卵形、卵形或纺锤形，长4～8cm，直径2。5～4。5cm。顶端长尖，基部锐尖或圆钝。表面灰棕色至深棕色，粗糙，上部环节凸起，基部有下陷的须根痕，芽痕及侧生根茎痕不明显，有刀削痕。质坚重，击破面黄棕色或黄灰色，角质状，具点状或条纹状维管束。主要分布于浙江温州。其根茎或块根经过不同炮制后可分别制成 “温莪术”、“温郁金”、“片姜黄”3种中药，均是临床上的常用中药。From~优E尔L论E文W网wWw.YoUeRw.com 加QQ7520.18766

据《中国肿瘤》发布的最新恶性肿瘤的数据分析显示，我国2012年的新增肿瘤发病例为358。6万例[1]。恶性肿瘤依然威胁着人民的健康及生命，对于抗肿瘤药物的研究与探索任重而道远。β-榄香烯(β-elemene)是一种高效、低毒、广谱的天然抗肿瘤药物，从浙江省道地药材“浙八味”之一的姜科植物温郁金的块茎(Curcuma wenyujin)中提取而来。β-榄香烯具有诱导癌细胞凋亡、抗癌细胞转移、诱导分化、抗血管生成、抗耐药性、增强免疫力、放化疗增敏等生理活性。其主要生物学活性为降低肿瘤细胞有丝分裂能力，诱发肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的生长。时继慧等[2]1981年首次报道了榄香烯对小鼠艾氏腹水癌、小鼠网织腹水型细胞肉瘤、小鼠肉瘤37、小鼠肉瘤180、大鼠腹水型吉田肉的抗肿瘤活性，也是国内首次报道关于榄香稀的抗肿瘤活性。以榄香烯作为主要抗癌成分的药物已经证实对胰腺癌[3]、肝癌[4]、肺癌[5]、喉癌[6]等具有抗肿瘤活性。

1。2  合成生物学

合成生物学最初代表了两个互补方面的名词，一个是通过基因操纵现有微生物来获得自然界中不存在的生物系统，从而建立一个新的生物工程，另一个是化学合成生物学，主要采用化学的方法在实验室中合成自然界中不存在的生物结构。简单来说合成生物学就是用人工的手段制造生物系统，包含了两个方面的含义，一是对现存的生物进行改造，二是设计自然界中不存在的基因线路或者生物体、代谢途径等。β-榄香烯的主要来源包括：植物提取、化学合成、微生物异源合成。从植物中分离提取榄香烯成本高、产率低、纯度低，不能完全适应市场的需求。化学合成法合成β-榄香烯工艺复杂、毒副作用大，难以实现工业化。微生物异源合成法具有微生物遗传背景清楚易于改造、发酵周期短、生产成本低、产量高等优点。合成生物学研究中最著名的例子是抗疟疾药物青蒿素的合成生物学研究。2006年，Keasling等[7]宣布，通过合成生物学技术对一株酵母菌成功进行遗传工程改造，使得后者可以产生高水平的青蒿酸（Artemisinic Acid）—青蒿素的一种直接的前体。 J。 Westfall[8]等对酵母细胞进行了总共8次的基因工程改造，使青蒿酸最终的含量达到25g/L的水平，最终实现了青蒿素的半生物合成。青蒿素半生物合成路线的建立，使青蒿素的合成成本降低了10倍，是合成生物学技术在天然药物合成领域应用的重要成果。 温郁金吉马烯A合酶突变体的构建及催化性质分析(2):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_157360.html