目的:探讨在体条件下,非创伤性双下肢缺血后处理是否具有减轻心肌缺血/再灌注损伤(IR)的作用。方法:采用SD大鼠心肌缺血/再灌注模型,应用Evan’s蓝。TTC染色,观察非创伤性双下肢缺血后处理对心梗面积(infarctionsizeIS)的影响;并应用生化检测及免疫组化技术,研究非创伤性双下论文网肢缺血后处理磷酸肌酸激酶(creatinekinaseCK)。丙二醛(malondialehydeMDA)。超氧化物歧化酶(superoxidedismutaseSOD)对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的作用。结果:与缺血/再灌注组比较,非创伤性双下肢缺血后处理组的IS。MDA含量显著降低(P<0。01),而SOD含量明显升高(P<0。01),而CK值无显著性差异(P>0。05)。结论:非创伤性双下肢缺血后处理能有效降低心肌缺血/再灌注梗塞面积,其机制可能与减少自由基损伤和抗氧化作用加强有关。

关键字:缺血预处理再灌注心肌梗塞

[Abstract]Objective:Toobserveprotectiveeffectsofnon-woundlegsischemicpostconditioningonischemia/reperfusionmyocardialinjuryinrats,investigatetheeffectsofpostconditioningonischemia/reperfusionmyocardialinjury。Methods:30Sprague-Dawleyratsdividedrandomlyintofourgroupsandreproducethemodelofischemia/reperfusionmyocardialinjury。Wemeasuredtheinfarctionsizes(IS)withEvan’sandTTCdye,examinecreatinekinase(CK),malondialehyde(MDA)andsuperoxidedismutase(SOD)inourstudy。Results:Comparewiththeischemicreperfusiongroup,theISandtheconcentrationofMDAinplasmaofnon-woundlegsischemicpostconditioningwerelower,p<0。01,andtheconcentrationofSODinplasmaofnon-woundlegsischemicpostconditioningwerehigherthanthatoftheischemicreperfusiongroup。Comparewiththeischemicreperfusiongroup,therearenosignificanceinischemicreperfusiongroupandnon-woundlegsischemicpostconditioninggroup,p>0。05。Comparewiththeischemicpreconditioninggroup,theISandtheconcentrationofMDAandSODinplasmaarenosignificancebetweentheischemicpreconditioningandnon-woundlegsischemicpostconditioninggroups,p>0。05。Conclusion:Non-woundlegsischemicpostconditioninghasthesameprotectiveeffectsasischemicpreconditioningondecreasingtheinfarctionsize,thepotentialmechanismarethatdecreasedoxygenfreeradicalinjuryandstrengthenedtheactionofantioxidization。

1986年,由Murry等[1]首次提出缺血预处理概念(ischemicpreconditioning,IPC),即冠状动脉反复短暂的缺血可以使心肌在后续更长时间的缺血中得到保护。近年来,有研究证明肾动脉。肠系膜动脉及股动脉等远距非心脏缺血预处理对心肌亦有保护作用[2~5],亦有报道非创伤性双下肢缺血预处理对心肌有保护作用[6]。本文旨在探讨在体情况下,非创伤性双下肢缺血后处理对大鼠缺血/再灌注损伤的保护作用。

1材料和方法

1。1实验动物:健康SD大鼠24只,体重250±30g,购自贵阳医实验动物中心,雌雄不拘,随机分为4组,每组6只。

1。2动物模型制备及分组

1。2。1动物模型制备:实验大鼠以3。6百分号水合氯醛腹腔麻醉(10ml/kg),麻醉后固定于鼠台。分离气管,气管插管,连接微型动物呼吸机(浙江大学医疗器械厂生产)支持呼吸,频率50~60次/分,潮气量4~6ml/次将针形电极插入四肢皮下,连接心电图机(浙江大学医疗器械厂生产),记录标准导联心电图。经胸骨左缘2~4肋开胸,剪开心包,暴露心脏及左室表面血管,以左冠状动脉主干为标志,在左心耳根部下方2mm处进针,3/0丝线(结扎线)穿过心肌表层在肺动脉圆锥旁出针,在结扎线两端分别套入丝线环作为再灌注拉线,收紧结扎线以造成心肌缺血,牵拉再灌注拉线使结扎线放松后即行再灌注[7],以收紧结扎线后心电图S-T段抬高放松结扎线后S-T段下降1/2以上为模型成功,关闭胸腔。

1。2。2动物分组:①假手术组(shamgroup,S组),开胸后穿线做套环,但不收紧结扎线;②缺血再灌注组(ischemicreperfusiongroup,IR组),收紧结扎线,造成缺血40min,牵拉再灌注拉线使结扎线放松后行再灌注180min;③缺血预处理组(ischemicpreconditioninggroup,IPC组),缺血5min,再灌注5min,反复3次,而后重复IR组操作;④非创伤性双下肢缺血后处理组(non-woundlegsischemicpostconditioninggroup,N-WIPTC)组,操作同IR组,在再灌注同时捆绑双下肢5min,以不能触及股动脉搏动为准,松开5min,反复3次。

1。3心肌梗死范围的测定:于实验终点时取出心脏,原位结扎左冠状动脉主干,经主动脉逆行灌注0。5百分号Evan’s蓝2~3ml,分离无蓝染缺血区和蓝染非缺血区,将无蓝染缺血心肌以滤纸吸干后置于-20℃冰冻20分钟,垂直其长轴水平切片,每片厚1-2mm,置入1百分号TTC磷酸缓冲液(pH＝7。4)中37℃孵育20分钟,此时坏死区(necroticzone,NZ)呈灰白色(见图1),非坏死区(nonecroticzone,NNZ)呈深红色,其后将NZ和NNZ分离,滤纸吸干,置于AB104-N电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司生产)上称重。梗死范围以坏死心肌重量与缺血心肌重量(坏死区与非坏死区之和)之比表示。

1。4生化指标测定:于180min再灌注末,打开腹腔从下腔静脉抽取静脉血2~4ml,以4500转/分分离血清,-20℃保存待测。检测血清磷酸肌酸激酶(CK)。丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)(药盒购自南京建成生物工程研究所),严格按说明书操作。

1。5统计方法:所有数据经Excel2000软件统计处理。计数资料以绝对值和百分比表示,计量资料以均数±标准差(±s)表示。计数资料用c2检验,计量资料用方差分析。

2结果

2。1心肌梗死面积的比较

IPC组。N-WIPTC组与IR组心肌梗死面积比较显示(如表1),IPC组。N-WIPTC组梗死组织重量百分比显著小于IR组,P<0。01。P<0。05,而IPC组。N-WIPTC组组间比较无显著性差异,P>0。05,各组大鼠体重及左室重量比较无显著性差异。

表1各组心肌梗死面积。大鼠体重及其左室重量的比较

Tab1Comparisonoftheinfarctsizeandtheweight

ofratandtheweightofleftventricleinthegroups(±s)

GroupNZ(g)NNZ(g)NZ/NZ+NNZWeightofRatWeightofLeftventricle

IRIPCN-WIPTC0。277±0。0650。144±0。0160。198±0。0730。296±0。0600。401±0。0130。377±0。06948。31±8。15百分号26。39±1。71百分号★33。89±3。94百分号▲248。83±48。10243。57±35。17226。83±29。540。573±0。0750。545±0。0280。575±0。142

注:IPC组与IR组比较★P<0。01,N-WIPTC组与IR组比较▲P<0。05。

2。2血清生化指标的比较

IPC组。N-WIPTC组分别与IR组比较显示(如表2),IPC组。N-WIPTC组MDA浓度明显低于IR组,P<0。01;而SOD浓度明显高于IR组,P<0。01。IPC组。CK浓度明显低于IR组,P<0。01;N-WIPTC组与IR组比较,CK浓度无显著降低,P>0。05;与IPC组比较,有显著性差异,P<0。01。实验组各指标与S组比较,P值小于0。01。

表2各组CK。MDA。SOD浓度的比较

Tab2ComparisonlevelsofserumCKandMDAandSODinthegroups(±s)

GroupCK(U/ml)MDA(nmol/ml)SOD(NU/ml)

SIRIPCN-WIPTC36。27±11。90193。76±42。35▲102。75±15。18146。05±37。40△4。78±0。7910。70±1。36★6。72±1。436。87±1。30430。09±47。52141。90±14。52★251。56±37。12257。57±26。12

注:IPC组。N-WIPTC组与IR组比较其MDA。SOD浓度★P<0。01;IPC组与IR组比较其CK浓度▲P<0。01,N-WIPTC组与IR组比较其CK浓度△P>0。05,但与IPC组比较▲P<0。01。

3讨论

在动物实验和临床观察中也发现恢复血液再灌注后,缺血/再灌注损伤往往加重组织细胞功能代谢障碍及结构破坏,如何防治。减轻心肌缺血/再灌注损伤,是当今的研究热点之一,心肌缺血预处理是目前较公认的方法。缺血预处理的心肌保护表现在减少心梗面积。减少再灌注心律失常及心肌抑顿等[8~10]。在临床实践工作中,患者往往在出现严重缺血导致心肌梗塞后就诊,使上述预处理方法的应用受限,因此寻找一种非创伤性的心肌保护方法,必然为心肌缺血事件发生后开创新的临床治疗方法。

本研究显示:非创伤性双下肢缺血后处理组与IPC组的实验大鼠心肌梗塞面积比较无显著性差异;而IR组的大鼠心肌梗塞面积与非创伤性双下肢缺血后处理组比较有显著性差异。表明非创伤性双下肢缺血后处理有减少心肌缺血/再灌注损伤的作用,这与文献报道结果一致[11]。

心肌缺血时,机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基,使氧自由基的生成增加。氧自由基对心肌的损伤主要表现为脂质过氧化作用,即氧自由基与心肌细胞膜上的多不饱和脂肪酸结合,引起脂质过氧化作用,形成脂质过氧化物(lipidperoxide,LPO),引起细胞结构和功能的一系列改变,最终导致心肌细胞的损伤。体内最重要的LPO代谢产物是丙二醛(malondialehyde,MDA),故测定MDA能较好地反映组织脂质过氧化程度,间接反映出细胞损伤程度[12,13]。氧自由基清除酶如超氧化物歧化酶(SOD)。谷胱甘肽过氧化物酶等的活性降低时,导致氧自由基堆积,氧自由基可转变为羟自由基,其活性更强,使膜脂质过氧化,引起细胞膜的结构和功能损害,细胞膜结构遭自由基及脂质过氧化破坏后,可使细胞膜功能失调,进一步促进Ca2+内流增加,造成细胞Ca2+超载,激活Ca2+依赖蛋白水解酶,促进氧自由基生成,从而加剧缺血组织损伤。SOD是体内清除自由基的一种特异酶,其活性变化可反映体内抗氧化功能情况。本研究显示,非创伤性双下肢缺血后处理组(N-WIPTC组)MDA含量较IR组明显降低,而SOD含量明显增高,MDA含量和SOD含量与IPC组无显著性差异,提示降低MDA含量。增强SOD活性是非创伤性双下肢缺血后处理减少缺血/再灌注心梗面积的可能机制之一;N-WIPTC组的MDA含量和SOD含量与IPC组无显著性差异,说明缺血后处理与缺血预处理对随后的缺血再灌注损伤具有同样的心肌保护作用。

CK是一种存在于心肌细胞内的蛋白酶,当心肌细胞损伤或坏死时,CK便可通过受损的细胞释放到血液中,因此CK值可以作为反映心肌坏死程度的指标。本研究表明,N-WIPTC组的CK值与IR组比较无显著性差异,但与IPTC组和IPC组比较,有显著性差异,P值小于0。01,可能与双下肢反复结扎造成骨骼肌受损有关,与文献报道结果一致[14]。

Przyklenk[15]发现冠状动脉回旋支反复短暂缺血后,未经缺血预处理的左前降支在持续冠脉阻断后其心肌梗塞范围也明显减少。股动脉缺血预处理也表现出同心肌缺血预处理同样的保护作用,Birnbaum等[16]发现缺血等因素可刺激缺血骨骼肌的化学感受器,从而通过释放激素或者激活神经元的途径释放介质,如腺苷。缓激肽等激素类以及其他物质等,发挥远处组织缺血预处理心肌保护作用。

我们的研究结果提示,非创伤性双下肢缺血后处理与缺血预处理有同样的心肌保护作用,推测其可能机制有:①反复捆绑和松开下肢,可刺激儿茶酚胺释放增加,与受体结合后激活G蛋白和磷脂酶C(PLC),随之活化PKC,上调热休克蛋白(HSP)的转录而显示保护效应[17];②下肢捆绑后导致局部缺血缺氧,刺激血管内皮细胞内Ca2+浓度增加,使NO合成酶活化,产生并释放NO;NO可通过cGMP含量增加而减少Ca2+内流或抑制心肌细胞内Ca2+释放而发挥心肌保护作用;③下肢缺血/再灌注后处理过程中,局部缺血缺氧产生的氧自由基,产生与预处理相似作用,氧自由基在介导缺血预处理心肌保护起着重要作用[18,19]。

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