毕业论文

打赏
当前位置: 毕业论文 > 医学论文 >

离体人鼻咽癌细胞蛋白巯基亚硝基化修饰的组学研究(3)

时间:2020-07-03 16:41来源:毕业论文
本研究应用人鼻咽癌细胞株CNE-2为模型,选用体内生理情况下存在的NO供体GSNO作为工具药,处理人鼻咽癌细胞总蛋白发生巯基亚硝基化,采用Biotin switch法纯

本研究应用人鼻咽癌细胞株CNE-2为模型,选用体内生理情况下存在的NO供体GSNO作为工具药,处理人鼻咽癌细胞总蛋白发生巯基亚硝基化,采用Biotin switch法纯化S-亚硝基化蛋白,iTRAQ标记结合LC-MS/MS技术鉴定修饰蛋白。采用GO功能分析、String分析差异蛋白质的功能和细胞中的定位。综合分析鼻咽癌细胞蛋白潜在的S-亚硝基化修饰靶点。研究结果可为寻找治疗鼻咽癌新靶点提供线索,为探索鼻咽癌治疗新方法提供理论依据和技术支撑。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 细胞株

CNE-2细胞株系由浙江医院馈赠。

2.1.2 试剂

改良型RPMI-1640培养液购自Thermo公司;胎牛血清购自Thermo公司;0.25%胰酶购自Gibco公司;还原性谷胱甘肽(GSH)购自上海晶纯生化科技股份有限公司;Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;二甲基亚砜( DMSO) 购自美国Sigma公司;Hepes购自Solarbio科技有限公司;新亚铜树碱(neocuproine)购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;NP-40购自上海碧云天生物技术有限公司;MMTS购自Sigma公司;Biotin-HPDP购自Thermo公司;SDS购自BioRad公司;抗坏血酸购自国药集团化学试剂有限公司;iTRAQ标记试剂-8 plex购自AB sciex公司;Tris购自BioRad公司;DTT购自BioRad公司;IAA购自BioRad公司;Urea购自BioRad公司。

2.1.3 实验仪器

超级洁净工作台购自博讯实业有限公司医疗设备厂;高压灭菌器购自美国Zealway公司;T1-SM120型倒置显微镜购自Nikon公司;电子天平购自梅特勒-托利多仪器(上海有限公司);752型紫外可见分光光度计购自上海菁华科技仪器有限公司;酶联免疫检测仪购自Biorad公司;HF151二氧化碳培养箱购自力康发展有限公司;AFZ-1001-U艾科浦超纯水系统购自上海百特科技有限公司;SIGMA低温高速离心机;Milli-Q超纯水仪;LTO Velos质谱仪购自Thermo公司;Orbitrap-Elite购自Thermo公司;超声波系统150-96购自Biosafer公司;真空离心浓缩仪购自Eppendorf公司;小胶电泳系统Mini-PROTEAN Tetr购自BioRad公司。源^自·优尔|文\论]文'网[www.youerw.com

2.2 方法

2.2.1 GSNO的合成(避光)

400 mM酸化的GSH 0.4 mL(加入0.2 M HCL 0.2 mL),加入400 mM NaNO2 0.2 mL,混匀后室温反应15 min,用40% NaOH(约3-4 μL),调节pH=7.2,避光保存于冰浴上。合成的GSNO用去离子水稀释200倍后测定在334 nm处的吸光度。所得的吸光度值与摩尔吸光系数0.767相比,然后乘以稀释倍数,即求得合成的GSNO的浓度。

2.2.2 CNE-2细胞培养

CNE-2细胞以含10%灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基,在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。以0.25% 胰蛋白酶消化细胞,2-3天传代一次,细胞传代7次内取对数生长期细胞进行实验。

离体人鼻咽癌细胞蛋白巯基亚硝基化修饰的组学研究(3):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_55746.html
------分隔线----------------------------
推荐内容