RNA浓度的测定：取1 μl的RNA样品稀释至100 μl的DEPC水中，混合均匀后，在分光光度计上读取A260的数值。每个样品重复三次，取平均值。则RNA浓度=A260×4。0 μg/μl。

1。2。3 第一链cDNA合成

取2 μg总RNA用于cDNA合成，首先配置反应体系如下：

Components Volume

Total RNA ( 2 μg ) x μl

Oligo dT18 ( 0。2 μg/μl ) 1 μ

RNase-free ddH2O up to 12 μl

将配置好的混合物混匀后，离心短暂时间，置于70℃变性5 min，后冰浴30 s，短暂离心。在处理过的混合物中依次加入以下物质：

Components Volume

5×Reaction Buffer 4 μl

RNase inhibitor ( 20 U/μl ) 1 μl

dNTPs ( 10 mmol/L ) 2 μl

AMV RT ( 10 U/μl ) 2 μl

轻轻混匀后，置于PCR仪上，设置好逆转录反应的程序：：42℃，45 min；95℃，5 min；4℃，+∞。反应结束后，稀释一定倍数后备用。

1。2。4 RT-PCR（Semi-quantitative RT-PCR）

PCR反应体系内容和加样量如下：

Components Volume

2×Reaction Buffer 10 μl

Forward Primer（10 μmol/L） 1 μl

Forward Primer（10 μmol/L） 1 μl

cDNA x μl

ddH2O (8-x) μl

充分混匀并短暂离心后，置于已设置好扩增程序的PCR仪上反应。

1。2。5琼脂糖凝胶电泳

根据DNA样品片段大小配置适宜浓度的琼脂糖凝胶（利用电子天平准确称量琼脂糖，加入到TAE电泳缓冲液中，并加热熔化），冷却至60℃左右，加入少许溴化乙锭（Ethidium bromide, EB）使其最终浓度为0。5 μg/mL，轻轻摇晃以充分混匀，倒入冲洗干净制胶模具中，待其完全凝固，约15-30 min。等到凝胶完全凝结后，小心垂直拔出梳子，将其放入电泳槽内，然后向槽中倒入电泳缓冲液，至其没过胶面1 mm为宜。将混匀有loading buffer的DNA样品和核酸分子量标准Marker用枪小心注入到凝胶加样孔内，接通电源，红色为正极，黑色为负极（DNA样品是由负极往正极泳动），一般110 V 电压，电泳25 min。电泳完毕后，先关闭电源，再在凝胶成像仪上并进行分析。来*自-优=尔,论:文+网www.youerw.com

琼脂糖凝胶浓度与线性DNA的最佳分辨范围

琼脂糖凝胶浓度 线性DNA的最佳分辨范围（bp）

0。5% 1,000 ~ 30,000

0。7% 800 ~ 12,000

1。0% 500 ~ 10,000

1。2% 400 ~ 7,000

1。5% 200 ~ 3,000

2。0% 50 ~ 2,000

1。2。6 扩增得到的Egr-1基因连接到pMD18-T载体

先用20 μmol/L的姜黄素处理HepG-2细胞3 h，然后提取其总RNA，逆转录成cDNA，对PCR扩增获得的Egr-1 基因的CDS 区进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测正确后，切胶回收目的片段。为提高克隆的效率，利用Taq聚合酶具有末端转移酶（TdT）活性，在目的基因的3' 端加上一个非模板依赖碱基“A”，即经TA克隆构建pMD18-Egr-1 重组载体，将载体转化大肠杆菌并小提质粒，以获取pMD18-Egr-1质粒。 Egr-1基因表达质粒的构建及其在细胞中表达分析(4):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_81754.html