2。3 lentiCRISPR  v2 质粒的转化扩增 15

2。4 线性化 lentiCRISPR  v2 质粒 19

2。5 连接 gRNA 与载体 20

结论 23

致谢 24

参考文献 25 

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1 绪论

" 型 成 簇 规 律 间 隔 短 回 文 重 复 系 统 [Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated nuclease9(Cas9)]简称 CRISPR/Cas9 系统，它是在细菌与古 细菌体内发现的免疫防御系统，人们将其改造成为一种强大的基因组编辑工具。它有着相较 于 ZFNs 与 TALENs 明显的优势：①CRISPR/Cas9 在基因组中的靶位点含量较为丰富；② CRISPR/Cas9 能够同时对多个目标位点进行基因编辑；③构建相对便捷，设计简便，经济且 节约时间。

1。1 研究背景及其意义

21 世纪以来，生命科学领域取得了一系列巨大的突破，基因组编辑技术近年来更是 取得了长足的进步。近年来，科学家们将注意力集中到人工核酸酶上来，希望以此来开发 新的更加高效的基因组编辑技术，从而诞生了锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFNs） 与类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator like effector nucleases, TALENs） 技术，利用这些人工核酸酶在靶定的目标位点可以特异性地产生 DNA 的双链断裂（DNA double-stranded breaks，DSBs），从而通过细胞自身的非同源末端连接（Non-homologous ending-joining，NHEJ）或者同源重组（Homologous recombination，HR）来实现替换、敲 除、插入等基因定点编辑[1]。

1。2 锌指核酸酶，ZFNs

1983 年，锌指蛋白（ZFP）首次被发现于非洲爪蟾的转录因子Ⅲ A 中[2]，2001 年， Marina Bibikova 小组首次将锌指核酸酶应用于非洲爪蟾卵母细胞内，并以此成功介导细 胞同源重组，并得到了广泛认可[3]。作为第一代的人工核酸内切酶技术，ZFNs 技术的出 现促进了基因组编辑技术极大进步。锌指核酸酶有两个主要组成部分，它们分别是：锌指 蛋白（zinc fingers proteins, ZFPs）结构域以及非特异性核酸酶 FokⅠ[4]。每个锌指蛋白又 是由 3～6 个 Cys2 -His2 锌指蛋白结构域组成，该锌指蛋白结构域在转录调控因子中广泛 存在。锌指蛋白的 α-螺旋结合到 DNA 的大沟中，与核苷酸中的碱基相互作用，锌指蛋白 从而能够特异性识别并且结合 DNA。α-螺旋中的-1、3、6 氨基酸可以识别位于 DNA 同 一条链上 3'到 5'方向连续的 3 个碱基，这样，每个锌指蛋白就可以特异性地识别一个三

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联体碱基[5]。利用这个性质，只要人工替换三个关键位置上的氨基酸残基，而保留基本的 锌指结构不变，我们就可以得到可以识别不同特异位点的锌指结构域，将这些结构域串 联起来就得到了具有特异性且可与 DNA 结合的锌指蛋白。另一个组成部分 FokⅠ核酸酶 只有在二聚体的状态下才具有内切酶活性[6]，每个 FokⅠ核酸酶单体与一个 ZFP 单体结 合形成一个锌指核酸酶 ZFN，可以特异性识别相应的位点，所以如何构建并筛选出特异 性更好、效率更高的 ZFP 结构域是 ZFN 技术的关键步骤。当两个锌指核酸酶 ZFN 单体 识别的位点相距 6 ～8bp 时，这两个 ZFN 就产生相应的内切酶活性，剪切特定的双链位 置，在目标位点产生双链断裂[7]。DSBs 会引起真核细胞的损伤修复机制：NHEJ 与 HR。 NHEJ 修复会在靶位点造成碱基的插入或缺失，达到基因敲除的目的；而 HR 则是通过基 因的同源重组造成碱基序列的插入或者互换，达到基因敲除或者敲入的目的。ZFNs 技术 具有很明显的优势，但是因为其具有一定的脱靶效应，并且部分实验需要进行体外操作， 不仅如此，ZFNs 核酸酶的设计与组装过程十分复杂，代价高昂，这成为了限制其发展的 主要因素[8]。 利用CRISPR/Cas9构建RIP1基因敲除细胞(2):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_83614.html