1。3 类转录激活因子效应物核酸酶，TALENs

TALEs 是分泌自植物病原体—黄单胞杆菌的一类转录激活因子样效应物，它可以特 异性地识别并结合宿主 DNA，从而调控宿主基因特定效应物的表达。TALEs 在 N 端有一 个转运信号(translocation signal)，在 C 端有一个核定位信号(nuclear localization signals)和 酸性转录激活域(acidic activation domain)；同时，TALEs 还包含一个中间串联重复区，该 区域是介导其特意识别并结合 DNA 的结构域，由多个重复序列单元串联排列组成。这些 组成 DNA 结合结构域的重复序列单元有 33～35 个氨基酸残基构成，其中第 12 位和第 13 位的氨基酸残基是可变的，故称为重复双可变残基(repeat variable di-residue，RVD)， 而其他位置的氨基酸残基则高度保守。研究发现每个 RVD 可以识别一个 DNA 碱基，不 同的 RVD 能够特异性识别 4 种碱基中的一种或多种：NI 识别 A，NG 识别 T，HD 识别 C，NK 识别 G，NN 识别 G 或 A，NS 可识别 A、C、G、T 中的任一种[9]。因此，TALEs 的重复单元与目标序列具有良好的对应性，相对于 ZFNs，其特异性更加优秀，也更有利 于人工核酸酶的设计。利用 RVD 的这一性质，参照靶位点的碱基序列，将能够识别对应 碱基的 TALE 重复单元串联起来，我们就能设计出可以特异识别并结合 DNA 目标序列的 TALE 蛋白。将设计好的 TALE 与 Fok I 核酸酶融合起来，就形成了能够靶向识别并切割 目标基因的 TALEN。类似于 ZFNs 技术，两个 TALEN 分子与目标位点相结合，Fok I 在

本科毕业设计说明书 第 3  页

目标序列处切割 DNA 双链，形成一个 DSB，诱发细胞的 DNA 修复机制，通过 NHEJ 或

HR 实现对目标基因序列的编辑[10]。

目前来说，TALENs 的构建主要是通过分子克隆的方法。主要有：①Cermak 等开发 的 Golden Gate 法，如 Golden Gate-PCR、Golden Gate-Vector；②限制性酶切-连接法；③ 单元组装法（Unit Assembly）④自动化固相高通量方法（fast ligation-based automatablesolid- phase high-throughput，FLASH）等。现今，该技术已经广泛应用于动植物细胞以及人细 胞中，成为了一种重要的基因组定点修饰技术。

1。4 成簇规律间隔的短回文重复序列系统，CRISPR

第一、第二代人工核酸内切酶技术的出现极大地促进了生命科学的发展，但是它们 仍然有这各自的缺陷：ZFNs 成本高昂，组装过程复杂且成功率不高；TALENs 成本也比 较昂贵，同时其构建也较为复杂。这些因素导致 ZFNs 和 TALENs 难以在实验室得到大 规模的推广，近来，一种新的基因组编辑的突破性技术应运而生：CRISPR/Cas9 系统。该 系统早先发现于细菌和古细菌中，在其中起着抵御外源质粒和噬菌体的入侵的免疫防御 作用[11]。CRISPR/Cas9 系统具有记录入侵的外源 DNA 序列的功能，并能够将入侵的噬菌 体以及质粒 DNA 片段以间隔序列的形式整合到 CRISPR 中，这些间隔序列则转录生成一 段反义 RNA 与再次入侵的外源 DNA 序列进行互补配对，最后在 Cas9 蛋白的作用下被 降解，这样就抑制了外源 DNA 的转录与翻译，从而达到阻止噬菌体繁殖这样的防御作用

[12] 。 研究者们将该系统改造成一种人工核酸内切酶， 从而实现预期的基因编辑。

CRISPR/Cas 系统具有一些 ZFNs 和 TALENs 不能比拟的优点，例如：CRISPR/Cas 系统 有着较前者更好的拓展性，构建成本更加实惠，并且构建也相对容易，可以更加简便地进 行基因组编辑。

1。4。1 CRISPR 发展历程

早在 1987 年，日本大阪大学的课题组在研究 E。coli K12 碱性磷酸酶时，在其编码基 因附近发现一段串联的间隔重复序列，并在之后的研究中发现该类型重复序列普遍存在 于细菌与古细菌的基因组之中，但是该课题组并没有继续进行更深入的研究[11,13,14]。在 2002 年，Jansen 等将其正式命名为 clustered regularly interspaced short palindromic repects 利用CRISPR/Cas9构建RIP1基因敲除细胞(3):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_83614.html