利用CRISPR/Cas9构建RIP1基因敲除细胞(4)

（CRISPR）,即成簇规律间隔的短回文重复序列。2007 年，Barrangou 等首次在嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)中发现并通过试验验证， CRISPR 系统可以帮助细菌抵御噬菌体的入侵[15,17]。2011 年，Sapranauskas[16，17]等研究者首次证明 CRISPR 系统不仅能够

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在不同的菌种之间移植，并且它们仍可以有效保留作用。在 2012 年， Jinek 等研究者将 CRISPR/Cas 系统中的 tracrRNA 和 crRNA 改造成为单导向 RNA（Single-guide RNA， sgRNA），这种 sgRNA 可以指导蛋白质对特定的 DNA 序列进行靶向断裂。经过进一步研究，研究者们成功利用 CRISPR/Cas 系统对哺乳动物的基因组实现了定向切割，CRISPR 技术取得了重大突破性进展，并成为了炙手可热的遗传学研究技术。论文网

1。4。2 CRISPR/Cas 系统的组成及分类

CRISPR/Cas 系统包含基因组部分（CRISPR）和蛋白质部分（Cas），而基因部分由前导序列（leader sequence，LS）和 CRISPR 基因座组成[28]。前导序列 LS 是一段位于 CRISPR 系统 5’端的富含 A、T 的序列，其不具有编码活性，长度一般为几百个碱基，它在不同物种之间有着很大的差异，但是在相同物种中，前导序列 LS 却是高度保守的。CRISPR 基因座是由许多间隔存在的同向重复序列（direct repeat，DR）以及 DR 间隔间的短 spacer 序列构成，其中的 spacer 序列是高度可变的[28]，其长度一般为 20～72bp。

根据 Cas 的基因序列、CRISPR 基因中的重复序列以及 Cas 操纵子的组成的不同， CRISPR/Cas 系统可以划分为三种型号：Ⅰ型、II 型和Ⅲ型 CRISPR/Cas 系统。每种型号的 CRISPR/Cas 系统又可以分为不同的亚型，分别有：I‑A 到 I‑F, II‑A 到 II‑C, III‑A 和 III‑B。三种型号的 CRISPR/Cas 系统都具有 Cas1 和 Cas2 基因，所以研究者们认为 Cas1 和 Cas2 蛋白是 CRISPR/Cas 系统的核心蛋白。CRISPR/Cas 系统分类的主要标准在于其是否拥有特定的蛋白质：Cas3 蛋白起主要作用的系统称为Ⅰ型 CRISPR/Cas 系统，有七种亚型；Cas9 蛋白其主要作用的系统称为 II 型 CRISPR/Cas 系统，有三种亚型；拥有 Cas10 蛋白的称为Ⅲ型 CRISPR/Cas 系统，有两种亚型；没有上述蛋白的，称为未知型（Type U）。

1) Ⅰ型 CRISPR/Cas 系统

Cas3 基因是Ⅰ型 CRISPR/Cas 系统中其主要作用的基因，由它所编码的 Cas3 蛋白不仅具有 DNA 酶活性，还具有解旋酶活性，在干扰阶段，Cas3 蛋白起主要作用[29]。此外， Ⅰ型 CRISPR 基因座中还有着其他的 Cas 基因，它们编码的 Cas 蛋白形成复合体并在表达和干扰阶段起相应的作用。

2) II 型 CRISPR/Cas 系统

Cas9 基因是 II 型 CRISPR/Cas 系统中起主要作用的基因，它所编码的 Cas9 蛋白是 II 型 CRISPR/Cas 系统的重要组成部分。在细菌细胞中，crRNA 的成熟是在 tracrRNA 的指导下，在有 Cas9 蛋白存在的情况下由 RNaseⅢ催化进行的，在干扰阶段也有 Cas9 蛋白的参与。在哺乳动物细胞中，II 型系统的 crRNA 的成熟并不需要 RNaseⅢ的参与，只需

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要 Cas9 蛋白和 tracrRNA 的参与就可以实现 crRNA 的成熟。

3) Ⅲ型 CRISPR/Cas 系统

Cas6 基因是Ⅲ型 CRISPR/Cas 系统中其主要作用的基因，其编码的 Cas6 蛋白主要在表达阶段发挥作用。Ⅲ型 CRISPR/Cas 系统具有两种亚型：III‑A 与 III‑B，其在干扰阶段起重要作用的作用复合体分别是 Csm 和 Cmr。III‑A 亚型与Ⅰ型、II 型系统一样，作用于 DNA；而 III‑B 亚型则是作用于 RNA。利用CRISPR/Cas9构建RIP1基因敲除细胞(4):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_83614.html