我们首先注意到lmo4b过表达1体节时期胚胎中的前神经板，显示了dlx3和pax2a的表达是沿着anterioposterior部分（Figs.7C和D）减小。在注射后的胚胎与对照组间分别测量pax2a条纹的宽度并没有显示显著的不同，再次表明lmo4b相关的目标是在MHB之前的。Emx1和pax6b在1体节时期的端脑和视觉原始细胞中都存在，并且其区域比对照组更短更窄（Figs.7E和F）。端脑过表达的胚胎在神经胚形成后比对照组胚胎更短（Figs.7G和H）。

基因表达分析和形态学上的观察表明lmo4b过表达不利于眼部的特化和视觉囊泡的扩张，但不作用于囊泡扩张部分或者视觉囊泡中的细胞类型分化。在8体节时期，两边的的囊泡开始表达pax6b（Figs.7E和F）。18体节的时候囊泡开始从神经管分离并表达rx2，可用来区分视网膜细胞（Chuang and Raymond,2001;Chuang et al.,1999;Kennedy et al.,2004;Rojas-Munos et al.,2005）（Figs.7K和L）。这个观察区分了斑马鱼中lmo4b过表达的chokh突变体和rx2保持在细胞内侧的青鳉eyeless突变体(Rojas-Munoz et al., 2005; Winkler et al., 2000)，表明rx3的功能在视觉囊泡扩张中对细胞行为的直接作用(Rembold et al., 2006)。同样的，在青鳉six3突变的胚胎中，rx3表达的细胞未能分离到两边的区域中(Carl et al., 2002)。Lmo4b的过表达并不会完全切断six3或rx3的表达，我们得出结论：剩余表达six3和rx3的细胞保留正常模式和形态形成行为。

7.six3与lmo4基因间的相互作用决定前神经组织的大小和区域细分。

我们的结果与Lmo4的基本功能是负调节six3b表达的这个假设一致。为检验这个假设，我们通过在lmo4b过表达的胚胎中再注射six3b特异的玛琳或者mRNA来改变six3b的水平。我们首先确定是否可以通过降低six3b的功能来获得具有lmo4b功能的表型。如果lmo4b的主要功能是在前神经外胚层抑制six3b的功能，那么由于lmo4b缺失而扩大端脑和眼睛的效果将由于six3b功能的抑制得到进一步加强。对于six3b特异的玛琳实验，我们使用的玛琳将会同时阻碍six3a和six3b基因的转录（Andoh et al.,2005）。注射125pg的lmo4b mRNA对前脑和眼睛产生了较小的影响（Figs.8A和D）。类似的，胚胎注射8pg six3a/six3b特异的玛琳对眼睛与前脑的大小也只有轻微的影响(Figs. 8B and E)。然而，共同注射125pg的lmo4b mRNA和8pg six3b特异的玛琳对前脑产生了极强的抑制作用，特别是眼睛(Figs. 8C and F)。这个结果更加支持lmo4b在某种程度上通过抑制six3b的活性而发挥作用的这个结论。我们接着检验是否可以通过提高six3b的活性能补偿由于高水平lmo4b(750pg)过表达所产生的眼睛与前脑减小的结果(Fig. 7)。如果six3b被lmo4b抑制转录，那么通过注射six3b mRNA应该能在不受lmo4b作用的情况下提高six3b的活性，从而减弱由于lmo4b过表达抑制six3b所产生的各种表型。这个实验能使我们区分更改lmo4b后产生的对six3b下游转录或平行基因转录有关的作用。注射40pg six3b mRNA会增加头和眼睛的的尺寸(Figs. 8G)，而注射750pg lmo4b mRNA则会产生相反的作用(Fig. 7, Figs. 8H)。两者共同注射会使受精后28小时胚胎的头部增大但眼睛则会变小(Figs. 8I)。这些操作对于10体节时期胚胎端脑原基(emx1 positive, dark blue in Fig. 8J–L)和视觉原始细胞(pax6 positive, light blue in Fig. 8J–L)的作用是明显的(Fig. 8J–L)。因此，过表达six3b能克服由于lmo4b过表达引起的前脑减小的效果，但不会减小视觉原始细胞的大小。这表明lmo4b对眼部的基因产生负调控作用，但它的作用与six3b的转录无关。

六．讨论：

我们已经确认斑马鱼Lmo4b基因作为一个负调节器在斑马鱼端脑及眼的特化与发育中是必不可少的。我们也描述了最有可能说明lmo4b的活性与作用lmo4b表达的两个完全不同的阶段：萌芽阶段的前神经边界和3体节阶段后的端脑和眼部。我们也确认了six3b和rx3两个基因在前神经组织中是在lmo4b基因的下游并受其活性调控。我们的结果证明lmo4b在原肠胚后快速稳定前神经边界及限制前脑和眼睛的大小方面作用的重要性。特别的是，我们在对乳腺肿瘤及哺乳动物胚胎的细胞培养的研究结果中表明，脊椎动物LMO4基因不是一个专门调控细胞增殖的作用因子。 斑马鱼LMO4同源基因英文文献和中文翻译(5):http://www.youerw.com/fanyi/lunwen_50722.html