2。2 实验试剂

    植物总RNA抽提试剂盒购自QIAGEN公司；反转录试剂盒购自Tiangen公司；Real-time quantitative PCR所用试剂SYBR Green购北京康为世纪公司等。

2。3实验仪器

    高速台式离心机5424，恒温孵育器（ThermoStat plus），小型高速冷冻离心机5830R，均从 Eppendorf 公司购买；定量 PCR 仪 CFX96，凝胶成像仪，电泳仪，从 Bio-Rad 公司购买。

2。4 实验方法

2。4。1 实验材料收集

    利用土培法种植番茄野生型AC和无色不成熟突变体Cnr，分别收获3周幼苗期的根（root，R）、茎（stem, S）和幼叶（young leaves，L）， 完全盛开的花（fully-opened flower, FF），绿未成熟果幼果（immature green ，IMG），绿熟期果实（mature green，MG），破色期果实（Break，Br），粉熟期（Br+3）和完全成熟期果实（Br+7），如图1所示，样品于-80℃保存。每个样品保存3个生物学重复。

图 1番茄AC和Cnr不同生长时期的果实表型图示。

2。4。2  植物总RNA的提取

    利用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit 抽提上述植物样品的总RNA，具体操作步骤如下：

（1）分别称取番茄材料样品 100 mg，液氮速冻论文网

（2）在预冷的研钵中研磨成细粉

（3）加入450 μl提取缓冲液 RLT(已按 1％加入 β-巯基乙醇)，再加入液氮研磨至粉末状

（4）待粉末融化以后，加入1。5ml 离心管（RNase-free）中, 离心 8000 rpm，2 min

 （5）吸取相应的上清液，转移至 QIAshredder spin column(淡紫色，事先置于2 ml收集管内)离心13000 rpm， 离心 1 min

 （6）将滤液转移至新的1。5 ml离心管中，加入0。5倍体积的无水乙醇，颠倒混匀。

（7）吸取650 µL 混合液，转移到RNeasy Mini spin column 12000rpm 离心 1 min，(红色，事先置于 2 ml 收集管中)，离心 13000 rpm，1 min

 （8）向RNeasy Mini spin column 加入750 µl Buffer RW1，13000prm 离心 30 s后，倒掉滤液

 （9）向RNeasy Mini spin column 加入500 µl Buffer RPE，13000prm 离心 30 s后，倒掉滤液

（10）向RNeasy Mini spin column 加入 500 µl Buffer RPE,13000 prm 离心 2  min后，倒掉滤液

（11）空离心，13000 rpm ，1 min

（12）将RNeasy Mini spin column 将滤液转移至新的1。5 ml离心管中，加入 30-50 μlRNase-free water，室温放置 5 min， 13000 rpm离心1 min，即得到植物总RNA。

2。4。3 cDNA第一链合成

    将上述检测合格的植物总RNA 样品，利用北京天根 公司提供的的 FastQuantRT Kit （with gDNase）进行cDNA第一链的合成，具体操作如下：

（1）将 5×g DNA Buffer，FQ-RT Primer Mix，10×Fast RT Buffer，RNase-free water 在冰上解冻，备用。文献综述

（2）20 μl反应体系中加入1 μg总RNA，按照下表配制混合液，混匀后置于42℃，孵育 3min，然后置于冰上。

组成成分 使用量

5×g DNA Buffer Total RNA

RNase-free water 2 μl

1 μg

补足到 10 μl

（3）在上述反应体系中依次加入如下试剂： 

试剂 使用量

10×Fast RT Buffer 2 μl

RT Enzyme Mix 1 μl

FQ-RT Primer Mix 2 μl

RNase-free water 补足到 10 μl

（4）混合均匀后置于42 ℃孵育 15 min； 定量PCR技术分析番茄LeSPL-CNR基因表达模式(4):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_196121.html