油菜素甾醇(Brassinosteroids，BRs)是一种新型的甾醇类植物激素，对植物的生长发育有重要的作用，包括茎叶的生长、根的生长、维管组织的分化、育性、种子萌发、顶端优势的维持等。另外，对于植物的对环境胁迫的防御中也有重要作用。

    植物体内BRs的合成是非常复杂的过程，呈网络状。在BRs合成途径中，有多种合成酶参与，编码这些酶的基因发生突变后，植株的BRs合成受阻，表现出植株矮小的现象，这些植株被称为矮小突变体(dwarf mutant)。这些突变体往往因为植株体内BRs含量低而表现出植株矮小，叶片卷曲并且叶色较深的现象。来自优Y尔L论W文Q网wWw.YouERw.com 加QQ7520~18766

    我们前期的工作中筛选到了另一个编码BRs合成酶的基因DWF5。其编码的DWF5蛋白具有甾醇Δ7还原酶活性，在BRs合成过程中位于DWF1的上游，使得脱氢二烯醇(dehydroepisterol)转变为2,4-亚甲胆甾醇(24-methylenecholesterol)；DWF5基因突变能够引起BRs合成受阻，导致植株出现典型的矮化突变体的特征。BRs在植物的生长发育过程中起着极为重要的作用，其作用高效、广谱、无毒，在农业生产中有着十分广阔的应用前景。目前内源BRs合成的途经研究已有了长足的进展，但是有关外界环境因素对合成途径的调控，以及具体的调控机制研究都还有待深入。在获取和确认各类BRs合成突变体后，相信相关的机理研究可以更进一步。

1 材料与方法

1。1 材料

本实验使用的拟南芥野生型植株为Col-0，未经鉴定的dwf5突变体购自拟南芥种质资源库（ABRC）。

1。2 主要试剂和仪器

主要试剂：RNA提取试剂盒，DNA提取试剂盒。

主要仪器：离心机，PCR仪，凝胶电泳仪，水浴锅，移液器。

1。3 基因及编码蛋白生物信息学分析

使用ProtParam在线软件分析DWF5氨基酸序列的一级结构和理化性质(http://web。expasy。org/cgi-bin/protparam)；使用SOPMA在线软件预测蛋白二级结构组成(http://npsa-pbil。ibcp。fr/cgi-bin/npsa_automat。pl?page=npsa_sopma。html)；使用在线软件SMART预测蛋白保守功能结构域(http://smart。embl-heidelberg。de/)。

1。4 突变体验证

1。4。1 植物基因组DNA的提取

植物基因组DNA的提取使用康为公司的植物基因组DNA提取试剂盒，方法如下：

在1。5ml离心管中放入100mg的植物新鲜组织，加入液氮充分研磨成细粉，向离心管中加入700μl 65℃预热的Buffer GP1，迅速颠倒混匀。将离心管放置于65℃水浴锅中水浴20分钟，间隔几分钟就颠倒混匀离心管中的样品。加入700μl氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5分钟，再转移上清入新管，加入700μlBuffer GP2，充分混匀。将所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，离心1分钟后弃废液，将吸附柱重新放回收集管。加入500 μl Buffer GW1，离心1分钟后弃废液。再加入500μl Buffer GW2，离心1分钟后弃废液，再 离心2分钟，倒掉收集管中的废弃液。将吸附柱放置于室温10分钟，使其彻底晾干。将吸附柱放置于新管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50μl  Buffer GE，室温放置10分钟，离心1分钟，再重复一次。收集DNA溶液，-20℃保存DNA。论文网

1。4。2 三引物扩增法验证纯和突变体

设计和使用三引物扩增法验证购买突变体是否纯合。预期PCR结果如表1所示。

野生型植株DNA经过PCR，利用LP和RP这对引物可扩增出1031bp的产物；杂合突变体的基因组DNA经过PCR，利用LP和RP能扩增出1031bp的产物，同时利用BP和RP引物还能扩增出750bp的产物；纯合突变体的基因组DNA经过PCR，只有BP和RP能扩增出750bp的产物。  拟南芥dwf5突变体的验证(2):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_196349.html