生长激素基因是影响动物生长发育的重要功能基因，克隆华鳈GH基因，对其核苷酸序列进行比较，并在群体中检测该基因种间特异性，将可能揭示华鳈种间经济性状差异的分子基础，在分子水平对华鳈的种质资源特性进行研究，为华鳈的分子育种提供科学的理论依据和相关技术。在研究中，还进行了种间亲缘关系分析，对华鳈分子辅助育种具有积极的意义。

2  材料与方法

2。1 研究材料

2。1。1  材料与试剂

华鳈   从洪泽湖中捕捞 

LB AMP+   有氨苄青霉素LB液体培养基

LB AMP-   无氨苄青霉素LB液体培养基

Gel Extraction Kit 快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒   康为世纪生物科技有限公司

AGAROSE G-10 琼脂糖

HiFi-Script  cDNA第一链合成试剂盒 北京康为世纪生物科技有限公司

2。1。2  实验仪器设备论文网

VORTEX-5 震荡器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司

Mini-7k 微型离心机 杭州奥盛仪器有限公司

Gel Doc TM EZ Imager 凝胶成像系统 

DYY-6C型 电泳仪电源 北京市六一仪器厂

UVG20 紫外分析仪 上海领成生物科技有限公司

Eppendorf 单道微量可调移液枪 

ND-2000C微量紫外分光光度计 Gene Company Limi 基因有限公司

DK-S24电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司 太仓精宏仪器设备有限公司

SN210C灭菌锅

HPS-160 生化培养箱 

DH6-914385-Ⅲ 电热恒温鼓风干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司

IMS-100 全自动雪花制冰机 常熟市雪科电器有限公司

TGL-16GB 高速台式离心机 上海安亭科学科学仪器

BSA124S 电子天平 塞多利科学仪器（北京）有限公司

2。2  研究方法

2。2。1 RNA提取过程

1。取一盒冰，一个培养皿，将组织取出后立即置于冰上，防止RNA降解。

2。取一条华鳈，麻醉，分别切取皮肤、肌肉、肾脏、精巢、脾脏、肠、心脏、中脑、下丘脑和垂体这10个部分各50 mg左右的组织，迅速地加入500 μL TRIzol Reagent提取液的2 mL的EP管中，用匀浆器在冰上将样品彻底匀浆。

3。匀浆后的样品在室温下放置5 min，以彻底分裂核蛋白复合体。

4。加入0。1 mL氯仿剧烈摇晃15 s，使充分混合后室温静置2-5 min。

5。12，000 r/min（10000 g）于4 ℃离心15 min，离心后分三层，底层为红色有机相，中间层为蛋白，上层为无色水相，RNA主要存在于水相中，水相体积约为所用TRIzol的60%。

6。转移上清至另一只无RNase的1。5 mL EP管中，加入0。25 mL异丙醇，混合静置10 min。

7。12，000 r/min于4 ℃离心10 min，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

8。倒掉上清，加入0。5 mL 75％乙醇（375 μL无水乙醇和125 μL DEPC处理的无菌水）洗涤，能见到白色片状沉淀。

9。9，000 r/min于4 °C离心5 min，尽可能地倾去废液，空气干燥5-10 min（在RNA操作台上进行），加无RNA酶水（25-200 μL）溶解2-3小时。

10。用无RNA酶枪头吸取1 μL RNA在D2000分光光度仪上测定其浓度以检测RNA质量。RNA质量也可用电泳法检测：用1 μL RNA在1。0 %的琼脂糖凝胶上进行电泳，如果呈现明显的两条带，且第一条带是第二条带亮度的两倍的样品认为是高质量的RNA。

11。检测合格的RNA可立即用于cDNA的合成或放置−80°C冰箱保存待用。

2。2。2 反转录文献综述

1。将RNA模板、primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFiScript和RNase-Free water 溶解并置于冰上备用。 华鳈GH基因克隆和多样性分析(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_201147.html