摘要： 本试验利用实验室构建的转基因沉默植株经EMS诱变恢复基因表达的体系来研究转基因沉默机制，以期探究水稻转基因沉默的机制。des3-1(Defective Epigenetic Silence3)是可使转基因沉默后再次恢复转基因表达的突变体，本研究以 des3-1 为研究对象，利用 F2分离群体进行基因定位,将该基因定位于水稻的第2条染色体短臂上，位于 InDel32与 InDel33 标记之间，物理距离 68.1kb，经测序发现：DES3（LOC_Os02g05880，MSU）编码 RNA 聚合酶 Rpb1，它的第 17 个外显子内的一个碱基 C 突变为 T，密码子由 CAG 变成 TGA，翻译由谷氨酰胺变为终止子。在水稻、拟南芥与玉米中利用系统进化树分析，发现 DES3（LOC_Os02g05880）与 NRPE1、ZmNRPE1 同源性最近，有趣的是水稻中还存在 OsNRPE1a 与 DES3（OsNRPE1b）为同源基因。DES3 的成功克隆为研究水稻转基因沉默机制奠定了基础。 27444
毕业论文关键词：水稻；RNA 聚合酶；基因沉默；基因定位
DNA dependent RNA polymerase V regulates rice transgenic silencing  
Abstract:  In  this  study,  the  transgenic  silencing mechanism  constructed  by  the  laboratory was  used  to study  the  mechanism  of  transgenic  silencing  by  EMS  mutagenesis  transgenic  gene  silencing  recovery mutant in order to explore the mechanism of transgenic silencing in rice. Des3 is a mutant that can restore the transgene expression again after silencing of the transgenic gene. In this study, des3-1 was used as the research object, and  the F2 population was used for gene mapping.Finally  the gene was  located  in rice of the second chromosome on the short arm, located between the InDel32 and InDel33 markers, the physical distance of 68.1kb, the sequencing found: DES3 encoding RNA polymerase Rpb1 gene LOC_Os02g05880 (MSU) whose  seventeenth  exon C mutation  to T, amino  acid  codon  changed  from CAG  to TGA,  amino acid from glutamine to terminator. The results showed that DES3 (LOC_Os02g05880) was homologous to NRPE1  and  ZmNRPE1  in  rice,  Arabidopsis  thaliana  and  maize  using  phylogenetic  tree.  Interestingly, OsNRPE1a  and  DES3  (OsNRPE1b)  were  homologous  in  rice.  Successful  cloning  of  DES3  laid  the foundation for the study of transgenic silencing mechanisms in rice. Key words:rice；rice; RNA polymerase; gene silencing；gene mapping
目  录
 摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 实验方法 2
1.2.1  des3-1 株高测量2
1.2.2 定位群体的构建2
1.2.3 引物的筛选2
1.2.4 基因的定位2
1.2.4.1 基因的初步定位2
1.2.4.2 基因的精细定位3
1.2.5 目的基因的确定3
1.3 DNA 的提取、PCR 扩增和电泳检测3
1.4 叶片取样提 RNA4
1. 5系统进化树分析 4
2 结果与分析4
2.1材料基因型鉴定结果 4
2.2  des3-1 的株高与 OsGA2ox1 的基因表达量分析5
2.2  3 OsGA2ox1  35S 启动子的 DNA甲基化水平分析 5
2.4 基因定位6
2.2.1 基因的初步定位6
2.4.2 基因的精细定位6
2.5 候选基因预测7
2.6 目的基因图位克隆7
2.7 系统进化树分析8
3 讨论8
致谢10
参考文献10
附录11
 随着转基因技术的发展，国内外实验室经常遇到转基因沉默的现象。对转基因沉默机制的研究已经成为了当今生物技术研究领域的热点。转基因沉默受到各种因素的影响，在转基因植株的当代或后代中，都会出现转基因表达受到抑制的现象。目前，对转基因沉默机制的研究还不够深入全面，转录调控导致基因沉默的机制还不清楚，特别是在单子叶植物中。 水稻作为单子叶植株的模式作物，对其基因沉默相关基因的图位克隆，进而研究基因转录调控机制，探究基因沉默原因，具有重要意义。 研究中发现的转基因沉默的主要机制有： （1）转基因位置效应导致的基因沉默：发生在 DNA 水平上的转基因沉默叫做位置效应。当导入的外源基因随机插入到宿主细胞基因组时，如果插入到转录活跃区域，则有较高可能进行高水平的转录，如果外源基因插入到转录不活跃区域，就可能进行低水平的转录，甚至不能转录。 （2）转基因位点多拷贝导致的基因沉默:在转基因的方式中,直接转化法常常引起多拷贝转基因在宿主细胞中的整合，单位点整合和多位点分散都会使转基因植株发生比较高机率的基因沉默。因为，多拷贝转基因序列之间和转基因与其转录产物之间会产生碱基配对，导致整合位点的染色质发生异染色质化或使 DNA 从头甲基化，阻碍了转录因子与基因的接触，使转录受抑制，引起转录水平上的基因沉默。（3）转基因反式失活导致的基因沉默：反式失活的定义是：某一基因的失活，引起同源的等位或非等位基因失活，这种转基因失活可以借助有性生殖过程的基因分离重组而发生逆转。另外，这种转基因失活类型发生的原因是：基因启动子间同源序列的相互作用，一般启动子区域有 90bp 的同源序列的情况下，即可发生两个基因间的反式失活现象[1]。（4）表观遗传导致的基因沉默：表观遗传是指转基因的DNA 序列不发生变化，但是，却可以引起可遗传的基因表达调控变化。其中，RNA介导的DNA 甲基化(RNA-directed DNA methylation ，RdDM) 首先在植物类病毒的复制中发现。通过RNA介导DNA 的甲基化，使外源基因甲基化或者异染色质化,诱发转录水平基因沉默。[2]。 （5）双链RNA模型导致的基因沉默：当外源基因整合到受体基因组中的方向不同时, 将会导致有义 RNA 与反义 RNA 的合成,从而形成双链RNA。双链RNA引发了一种核酸酶的活性从而使内源靶 mRNA降解。 无论是对转基因沉默机制的新发现，还是对已发现的机制进行深入研究，都少不了对相关基因的研究，而基因定位则是作为基因研究中的基本的、至关重要的一步。本研究利用独特的筛选体系获得转基因沉默后通过 EMS 诱变使转基因恢复的材料进行相关基因的定位，从而，更加深入全面地研究外源基因失活机制。另一方面，对基因沉默机制的研究，将会使人们更加深入全面地理解分子生物学等相关学科，为遗传学理论基础的扩宽奠定了基础。 1  材料与方法  1．1  材料 本实验室在 TP309 中超表达赤霉素氧化酶基因，转基因植株表型为赤霉素缺失表型，转基因植株种植了几代之后，出现了正常表型的植株，将正常表型的植株经 EMS诱变，得到了具有赤霉素缺失表型突变体库，从突变体库中得到与转基因沉默恢复表达相关的des3-1突变体。 TP309,OsGA2ox1 超表达株系(GAOE)OsGA2ox1-OE、转基因沉默株系 GAS（OsGA2ox1 Silencing），突变体des3-1以及构建 F2分离群体的籼稻背景的 TN1。 1．2  实验方法 1．2．1   des3-1株高测量 在成熟期分别测量 10株TP309、GAOE、GAS 与des3-1的株高。 1．2．2   定位群体的构建 F2代定位群体是由粳稻背景的突变体des3-1和籼稻品种TN1杂交 F1自交而得。 1．2．3   引物的筛选 在12 条染色体上较均匀地挑选 300对分子标记，进行突变体和 TN1的多态标记筛选，亲本间存在多态的标记再次在 F2群体中正常株 DNA 混合池与突变株 DNA 混合池中进行筛选。  1．2．4   基因的定位 1．2．4．1  基因的初步定位 将突变体与 TN1 杂交得到 F1代，F1代自交构建 F2群体，利用 F2代群体对目的基因进行基因定位。从 F2分离群体中，随机挑出 48 株表型为正常表型植株和 48 株赤霉素缺失表型植株，分别取样并提取 DNA，然后分别从 48 株正常表型植株的 DNA 中取等量混合成正常表型植株DNA混合池，从48 株赤霉素缺失表型植株的 DNA中取等量混合成赤霉素缺失表型植株 DNA 混合池。从突变体和 TN1 两个亲本及正常表型植株DNA混合池与赤霉素缺失表型植株 DNA混合池中筛选与目的基因连锁的分子标记。 并用F2代群体中的突变体验证，对基因进行初定位。 1．2．4．2  基因的精细定位 在初定位的基础上，根据籼稻背景 9311 与粳稻背景的日本晴测序序列，寻找 InDel标记，并将群体扩大到 978株，进行精细定位。 1。2。5  目的基因的确定 在Rice Genome Annotation Project (http://rice。plantbiology。msu。edu/)中下载定位区间内的所有候选基因的 DNA序列，通过一代测序进行测序分析，并确定目的基因。 1。3   DNA的提取、PCR 扩增和电泳检测 DNA依赖的RNA聚合酶V调控水稻转基因沉默:http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_21923.html