(2)种子插播

    消毒后，分别挑取完整饱满的种子96粒，分别将其在以正确方式插于经过高压灭菌处理并剪掉管底的96孔板中PCR 板小孔上。

(3)水培

    将两个 PCR 板放入盛有蒸馏水且经过紫外灭菌的黑色培养盒上进行水培，为了使水稻种子在生长过程中不被其它细菌污染，向培养盒的蒸馏水内注入适量链霉素。培养盒放置在恒温培养箱中，对水稻种子进行恒温避光培养。开始用蒸馏水水培，五天以后根据水稻的生长需求换用四分之一水稻培养液，十天以后换用二分之一水稻培养液，水稻培养液采用国际水稻所(IRRI)推荐的水培营养液配方。水稻苗在两叶一心时才可使用。

1.2 水稻苗期稻瘟菌粗毒素处理

(1)山口富夫培养液的配置（KH 2 PO4 ,K2 HPO 4 ,MgSO 4各0.5g/L,酵母浸出粉 5g/L,葡萄糖 20g/L)

(2)稻瘟病接种菌株Guy11。在超净工作台中挑取稻瘟病菌Guy11菌丝于山口富夫培养液25℃避光振荡(150 r/min)培养7-12天，等到稻瘟菌长好以后再用。

(3)将培养好的菌株用无菌纱布过滤，留取过滤出来的液体。将滤液分装至离心管中，然后将装有滤液的离心管在电子天平上两两配平。将配平好的离心管放入离心机中离心10min。滤液离心后，取离心管中的上层清液于玻璃瓶中，然后将该玻璃瓶放入高压蒸汽灭菌锅内，121℃灭菌 20min。灭菌完成后，即得稻瘟菌粗毒素原液。将玻璃瓶中灭好菌的粗毒素原液冷却后放入冰箱中，低温保存，备用。

(4)取出适量稻瘟菌粗毒素原液，将其稀释成1/4的粗毒素处理液，然后在恒温培养箱中用稻瘟菌粗毒素稀释液将丽江新团黑谷和谷梅二号活体水稻苗根部分别处理0h、6h、12h、24h、48h。分别取地上部分的叶和地下部分的根，放入-80℃备用。

1.3 水稻RNA提取与荧光定量分析

RNA提取采用Invitrogen公司的Trizon试剂。总RNA在经过Invitrogen公司DNA酶消化试剂盒处理后进行反转录。cDNA第一链反转录利用来自Takara公司AMV反转录酶进行，具体操作步骤如下所示。反转录完成后，将cDNA保存于-80℃备用。荧光定量实验在ABI公司7500型Real-time PCR仪中进行。采用2-ΔΔCT 方法计算基因相对表达量[14]。