三叶青扩展蛋白家族基因全长cDNA的克隆及分析

摘要根据GenBank中登录的扩展蛋白基因保守区域序列设计1对简并引物, 以三叶青球形块根cDNA为模板, 首先克隆获得三叶青扩展蛋白基因479 bp的保守片段, 再结合RACE技术, 获得三叶青扩展蛋白基因全长cDNA序列(命名为Th-exp), 共782 bp, 其中包含630 bp开放阅读框, 编码209个氨基酸。Th-exp编码的蛋白质具有典型的扩展蛋白结构特征，N端含有8个半胱氨酸的结构域, C端含有4个保守的色氨酸结构域, 中间含有组氨酸功能域。Blast分析显示, Th-exp与葡萄、醉蝶花中扩展蛋白基因具有相似性。半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析表明, Th-exp在三叶青叶、茎、普通细根和球形块根中均有表达, 但球形块根中表达强于其它器官。47429

Abstract According to the conservative region sequences of expensin gene in GenBank database, one pairs of degenerate primers was designed for RT-PCR. The conservative region fragment with length of 479 bp was first amplified from cDNA template of Tetrastigma hemsleyanum. The full-length sequence of expansin gene cDNA (named as Th-exp) was extended by RACE (rapid-amplification of cDNA ends). Th-exp gene contains a 630 bp open reading frame, which encoding a protein of 209 amino acids. The protein encoded by Th-exp habours a typical characteristic expansin structure, including 8 cysteine domain in N terminal region, 4 conserved tryptophan domain in C terminal region, histidine function domain in intermediate region. Blast alignment showed that Th-exp is similar to expansin genes of Vitis vinifera and Tarenaya hassleriana. Semi-quantitative RT-PCR and fluorescence quantitative PCR indicated that Th-exp can express in all of leaf, stem, ordinary fine root and calabash-shaped root, while the expression level in calabash-shaped root was higher than other organs.

毕业论文关键词三叶青; 扩展蛋白基因; 克隆; 表达

Key words Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg; expansin gene; clone; expression

引言.5

1. 材料与方法5-7

1.1 材料

1.2 RNA的提取和cDNA第一链的合成

1.3 引物的设计和合成

1.4 扩展蛋白基因中间序列的克隆

1.5 扩展蛋白基因5´和3´端序列的克隆

1.6 扩展蛋白基因全长cDNA的获得

1.7 扩展蛋白基因的生物信息学分析

1.8 扩展蛋白基因的表达分析

2. 结果分析7-12

2.1 扩展蛋白基因中间保守序列的获得

2.2 Th-exp基因全长cDNA序列的获得及生物信息学分析

2.3 Th-exp基因的表达分析

3. 讨论12

参考文献12-15

引言：

三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)又名金线吊葫芦、蛇附子、小扁藤、三叶扁藤、石老鼠等, 为葡萄科崖爬藤属植物, 是我国特有的珍稀濒危药用植物, 主要以块根入药, 具有清热解毒、消炎等功能, 近年来发现三叶青还具有抗肿瘤的功效[1,2]。三叶青主要分布在浙江、安徽、江西、福建等长江以南地区, 对生长环境要求苛刻, 它需生长在海拔700米的深山密林和悬崖峭壁的背阴面, 上面要有散射光, 旁边要有细水渗出, 下面要有树叶覆盖, 气温保持在18℃左右才有利于其生长; 而且, 在自然条件下其生长缓慢, 形成球形块根时间需要3-5年[3]。

扩展蛋白(expansins)是一个相对保守的基因家族, 由α、β、γ和δ 4个亚家族组成, 是植物细胞壁的重要组成部分, 广泛存在于各种植物细胞组织中[4]。有研究表明, 扩展蛋白的积累量与胚轴[5]、胚芽鞘[6]、节间[7]、叶片[8]和根系[9]等的生长有关。本研究从三叶青块根中克隆获得了扩展蛋白基因, 并进行了序列及基因表达的分析, 为进一步探讨扩展蛋白基因在三叶青块根发育中的作用奠定基础。三叶青扩展蛋白家族基因全长cDNA的克隆及分析:http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_49530.html