1.2 基因敲除原理

基因敲除技术又我们又称之为基因打靶,它是指从分子水平上将一个基因去除或让其被替代，然后从整体的表现形态上观察其实验动物的性状，推测相应基因功能的一种实验方法。而且基因敲除技术是功能基因组学研究的重要研究工具。基因敲除主要包括下列技术：①构建重组载体；②将重组DNA转入受体细胞核内；③筛选目的细胞；④转基因动物。源:自'优尔.·论,文;网·www.youerw.com/

在基因敲除中，传统的重组载体主要有插入性载体系统和替换性载体系统两种技术。首先来看插入性载体系统，插入性载体系统在构建载体时主要包括所要插入的基因片段(我们俗称的目的基因)、同源序列片段、标志基因片段等成分所组成。再来看替换性载体系统，替换性载体系统则主要包括这些，同源序列片段、替换基因的启动子、报道基因等成分所组成。基于对正负双向的筛选(positive and negative selection,PNS)策略和传统方法中的基因敲除需要满足条件：对基因组的提取处理可以用于构建载体所需要位于打靶区的两翼共同具有特异性而且具有足够长度的同源片段,并便于用其作为探针用Southern印迹作为证实；从而使Isl1/Isl2基因的整合；同源重组区域外侧基因(胸苷激酶基因)在随机重组时的活性；然后将打靶结构外特异的基因探针与合适的酶切位点进行整合, 便于用Southern印迹证实过程中出现特异大小条带分析。重组后若不能正确的排除由于基因对位置改变是否产生的影响,其属于长距离PCR中特殊序列的技术问题,如若不能控制打靶的组织类型及发育时段,不仅需时较长而且花费较大,这些弊端限制了研究工作的进行。近年发展起来的Cre-LoxP系统或F1p-FRT系统及转座子系统、基因捕获技术这些技术的发展。分别从不同方面解决了上述基因敲除中所出现的问题。