本实验采用的填料是QFF和UniQ-30s。采用单因素实验法，通过改变柱子填料、洗脱时间、洗脱液pH、尿素浓度等条件对分离效果进行优化，最后将分离出的峰通过电泳检测分离纯化的效果，已知目的蛋白大小为3kDa，需要除去的杂蛋白大小为14kDa。

离子交换层析的操作步骤如下：

①柱子（自装）：QFF填料、UniQ-30s填料

②层析柱的平衡：缓冲液A，平衡2倍的柱体积，至流出液的紫外检测吸收值保持不变。

③上样及再平衡：样品处理过后，匀速上样，上样结束之后再用A液进行平衡，至基线保持平稳。

④洗脱：平衡结束之后用缓冲液B进行梯度洗脱，按一个完整的洗脱峰来收集，并用SDS -PAGE电泳检测纯度。

⑤再生：用0.5M NaOH冲洗2倍的柱体积，再用蒸馏水冲洗至中性。文献综述

⑥保存：用20％的乙醇冲洗层析柱2倍柱体积并保存。

1.3.3 单因素实验（QFF柱） 

1.3.3.1  洗脱时间对分离效果的优化 

取酶切过夜样品，0.45μm膜过滤，取75ml样品，5倍稀释，上QFF柱。缓冲溶液A：100mM Tris-Hcl,缓冲溶液B：100mM Tris-Hcl，1M NaCl,pH8.0,梯度为0-100％，洗脱时间分别为：100min、150min。通过不同洗脱时间对分离纯化效果进行优化，确定最合适的洗脱时间。

1.3.3.2 不洗脱液pH对分离效果的优化 

取样品75ml，5倍稀释，上QFF柱。缓冲溶液A：100mM Tris-Hcl,缓冲溶液B：100mM Tris-Hcl，1M NaCl,梯度：0-100％，洗脱时间150min，设定缓冲液的pH：8.0、9.0、9.5、10.0，通过不同pH的洗脱液对分离纯化效果进行优化，确定最合适的缓冲液pH。

1.3.3.3  尿素浓度对分离效果的优化

取样品75ml，5倍稀释，上QFF柱，改变缓冲液中尿素浓度，缓冲液A：50mM Tris-Hcl，Urea，缓冲液B：50mM Tris-Hcl，Urea，1M NaCl，缓冲液pH10.0,梯度：0-100％，洗脱时间150min。设定缓冲液中尿素浓度：0.5mol/L、1mol/L、1.5mol/L、2mol/L。通过缓冲液的不同尿素浓度对分离纯化效果进行优化，确定

缓冲液的最适尿素浓度。

1.3.4 单因素实验（UniQ-30s）

1.3.4.1 

通过上QFF柱发现分离纯化GLP-1类似物的最佳pH为10.0，所以后续实验不再改变pH，且发现尿素浓度为2mol/L时，去除杂蛋白效果理想，所以不再改变尿素浓度。

1.3.4.2 Tris浓度对分离效果的优化 

取样品75ml，5倍稀释，上QFF柱，改变缓冲液中Tris的量，缓冲液A：Tris-Hcl，2M Urea，缓冲液B为Tris-Hcl，2M Urea，1M NaCl,缓冲液pH10.0,梯度：0-100％，洗脱时间200min。设定缓冲液中Tris浓度：50mmol/L、100mmol/L。通过缓冲液中不同的Tris浓度对分离纯化效果进行优化，确定缓冲液的最适Tris浓度。

1.3.4.3洗脱时间对分离效果的优化 

取样品75ml，5倍稀释，上QFF柱，缓冲溶液A：100mM Tris-Hcl，2M Urea,缓冲溶液B：100mM Tris-Hcl，2M Urea，1M NaCl,pH10.0,梯度：0-100％，洗脱时间：200min、250min。通过不同洗脱时间对分离纯化效果进行优化，确定最合适的洗脱时间。

2 结果与分析

2.1 制备GLP-1类似物

    菌体质量为800g，加入TE的量为6L，细胞破碎两遍，离心去除上清之后的包涵体湿重为270g，加入蒸馏水溶成2.6L水溶液。加入尿素2080g，0.5M/L EDTA  13ml ，Na2SO3 80.6g ，Na2S4O6 40.3g，室温变性过夜后，制备成20L复性液，加入溶解后的碳酸钾82.8g，抽真空，充氮气，加入L-cys-Hcl ，抽真空，充氮气，复性过夜，加入硫酸铜2ml，通过3k纤维素膜浓缩后，将溶液pH调至9.0，加100ml rEK酶切过夜。来*自-优=尔,论:文+网www.youerw.com

2.2离子交换层析分离（QFF柱） 利用离子交换层析纯化GLP-1类似物的研究(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_81355.html