本实验所采用的Y。e。p非特异性核酸酶是一种来源于Yersinia enterocolitica subsp。Palearctica的非特异性核酸酶。实验前期，将Y。e。p非特异性核酸酶基因用Nde I 和Xho I 进行双酶切，并与同样双酶切的PET24a(+)连接，转化至大肠杆菌BL21starTM(DE3)plysS表达载体，构建好了基因工程菌。通过与来源于 Serratia marcescens的核酸酶的氨基酸序列进行序列比对，推测出有两对二硫键。在蛋白质浓度一致的情况下，将突变体与野生型核酸酶进行热稳定性比较，从而研究二硫键对Y。e。p非特异性核酸酶热稳定性的影响。

1。材料和方法

1。1实验材料

1。1。1 菌株与质粒 

重组质粒pET24a-nuc                   由本实验室保藏

大肠杆菌E。coli DH5α                   购自北京GenStar 公司

大肠杆菌BL21starTM（DE3）plysS       购自Novagen 公司

1。1。2 酶与试剂盒  甲基化酶Dpn I、DNA Marker、BCA法测定蛋白质浓度试剂盒、2×Pfu  PCR StarMix、质粒DNA小提试剂盒、DNA胶回收试剂盒

1。1。3 主要试剂  酵母粉、胰蛋白胨、氯化钠、琼脂粉、氯化镁、50×TAE 缓冲液、IPTG、硫酸卡那霉素、小牛胸腺DNA、Tris-HCl (pH 6。8) 缓冲液、6×Sucrose DNA Loading buffer、琼脂糖

1。1。4 培养基和工作液 

LB培养基：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，固体培养基中需加入10g/L的琼脂粉。

卡那霉素溶液：取0。050g 硫酸卡那霉素溶于1。0 mL ddH2O中，配成50mg/mL母液，过滤除菌，分装到小管中，-20 ℃保存。

IPTG 溶液：取0。238g IPTG 溶于10 mL ddH2O 中，配成0。10 M 母液，过滤除菌，分装到小管中，-20 ℃保存。

小牛胸腺DNA底物溶液： 取0。041 g MgCl2·6H2O和0。001 g小牛胸腺DNA溶于200 µL pH 6。8，1 M的Tris-HCl缓冲液，最后加ddH2O定容至10 mL。

1。1。5 实验仪器 锥形瓶、烧杯、玻璃棒、量筒、pH计、电子天平、恒温摇床、烘箱、高压蒸汽灭菌锅、电泳仪、凝胶成像系统、PCR仪、离心机、紫外可见光分光光度计、超净工作台、水浴锅等。

1。2 实验方法

1。2。1二硫键预测

    序列比对Serratia marcescens 核酸酶 和 Yersinia enterocolitica subsp。 Palearctica 核酸酶的氨基酸序列，预测Y。e。p非特异性核酸酶的二硫键组成

1。2。2二硫键质谱分析

   Y。e。p非特异性核酸酶的二硫键质谱分析由上海中科新生命科技有限公司完成。

1。2。3 定点突变

1。2。3。1 定点突变原理

目前，定点突变的方法很多，而最简单的定点突变方法是快速定点突变法，该方法最早由Stratagene公司研究报道，其原理是：设计长度通常为30个碱基以上的互补的、含有预期突变的两个引物，然后以待突变的质粒为模板，用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变位点的双链质粒，这个双链质粒质粒中有两个nick位点。待突变的质粒通常来源于大肠杆菌等细菌，在细菌中会被甲基化修饰，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用甲基化酶DpnⅠ处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。这样把DpnⅠ处理过的产物转化细菌后，质粒中有两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒。