图1。1 pMD19-T载体结构

Fig1。1 The structure of pMD19-T

1。2。 化学试剂

酵母提取物、蛋白胨、氯化钠、Agar、牛肉浸膏、酵母浸膏、蛋白胨、蔗糖、硫酸镁、Amp、Kan、X-Gal、IPTG、液氮、三氯甲烷、异丙醇、20×TBE缓冲液、DNA Marke（Trans2000）等。TaKaRa公司T4 DNA连接酶、T缓冲液10×、BSA(10×)、Kpn I、Sal 、PrimeSTAR Max DNA PolymerasePCR、 MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver。4。0、pMD™19-T Vector Cloning Kit，康为世纪的高纯度质粒小提试剂盒、HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒、Trizol。

1。3。 培养基

1）LB液体培养基：酵母提取物1g、蛋白胨2g、氯化钠2g、水200ml，pH7。0，密封后高温灭菌。

2）LB固体培养基：酵母提取物1g、蛋白胨2g、氯化钠2g、Agar1。4g、水200ml，pH7。0，密封后高温灭菌。

3）YEB培养基:牛肉浸膏2g、酵母浸膏0。4g、蛋白胨2g、蔗糖2g、硫酸镁0。2g、水400ml，pH7。0，密封后高温灭菌。

1。4。 主要仪器

超微量紫外分光光度计（BioSpec-nano）、电热恒温振荡水槽（上海森信DKZ-450B型）、摇床（New Brunswick Scientific）、电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏DHG-9123A型）、单人净化工作台（苏州净化SW-CJ-ID型）、高速离心机（Eppendorf centrifuge5418）、高速台式冷冻离心机（Eppendorf centrifuge5810R）、PCR仪（Applied Biosysterms 2720 Thermal Cycler&Long Gene A200Gradient Thermal cycler）、荧光定量PCR仪（Applied Biosysterms StepOnePlus）、电泳仪（Amersham Biosciences EPS601）、凝胶成像系统（BIO-RAD）、-20℃低温冰箱（Electrolux BCD-235F）、-80℃低温冰箱(SANYO MDF-U32V)等。

2。 研究方法

2。1。 苦蘵不同部位总RNA提取（Trizol法）

1）由于RNA极易降解，所以实验过程中用到的枪头、离心管等最好用DEPC（diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）处理，高温灭菌并过夜烘干后使用，实验全程需要带一次性口罩及手套。

2）首先使用实验室准备好的液氮预冷研钵，然后取适量新鲜的苦蘵组织放到研钵中，并迅速研磨至粉末状，研磨过程中还需要补加2到3次液氮。

3）用药匙取适量粉末，转移到预冷的2ml离心管中，取 l200μl Trizol迅速加入到离心管中，激烈震荡混匀后室温静置10min。

4）在4℃条件下,12000rpm转速离心10分钟，取上清至新的离心管。来*自-优=尔,论:文+网www.youerw.com

5）加入200μl三氯甲烷，激烈震荡混匀后室温静置15min

6）在4℃条件下,12000rpm转速离心15分钟，取上清至新的离心管。

7）加入等量预冷的异丙醇，轻轻倒置混匀后，冰置30min。

8）在4℃条件下,12000转速下离心10分钟，弃去上清，加入DEPC处理的75%乙醇溶液，温和地震荡离心管使沉淀悬浮起来。

9）在4℃条件下,12000rpm转速离心5分钟，尽量弃上清，室温下风干。

10）加入20至30μl DEPC水，60℃溶解5至10分钟，-20℃保存。

2。2。 RNA质量检测

1）首先用1倍的TBE缓冲液配制完成1%的琼脂糖凝胶，然后把上一步得到的样品进行琼脂糖凝胶电泳。

2）使用超微量紫外分光光度计测取RNA样品的OD值及浓度。