3 实验方法

3。1 cel1b和β-act的启动子(Pact)扩增的引物设计

（一）cel1b扩增的引物设计

根据cel1b的DNA片段序列，引物设计cel1b-Act-F为ATTAATCAGTCACAATGCCC GAGTCGCTAGCTCTGC，cel1b-R引物的序列为ATTATATATAAGCTTCGACAGAGAGGG GCCAAGGG，虚线部分为HindIII酶切位点，引物cel1b-Act-F和cel1b-R均为赛百盛基因技术有限公司合成。文献综述

（二）β-act启动子扩增的引物设计 

根据β-act启动子的DNA片段序列，引物设计Act-XbaI-F为TATATATATCTAGACACA GCAGAAGGGGGTTCCGTCAAC，虚线部分为XbaI 酶切位点，cel1b-Act-R为ACTCGGG CATTGTGACTGATTA ATGTATGAAGCTGATGAAAG，引物Act-XbaI-F和cel1b-Act-R均为赛百盛基因技术有限公司合成。

3。2 cel1b和Pact的PCR扩增

3。2。1 cel1b的PCR扩增

(一) 基因组DNA的提取

基因组DNA的提取采取CTAB法[11]。取冷冻菌丝，加液氮研磨至粉末状，移至离心管，加2ml的CTAB提取缓冲液（CTAB在65℃水浴预热），65℃保温1h，间或轻摇混匀。1h后以9000r/min的速度离心10min。然后小心吸取上清液，加入相同体积的氯仿：异戊醇溶液，抽提10min（涡旋混匀，放置10min），13000r/min，离心10min。取80%的上层液体（尽量多取）加相同体积预冷异丙醇，-20℃沉淀30min，10000rpm离心10min，之后取沉淀，加500µL NaAc。加入氯仿-异丙醇，-20℃沉淀30min，10000rpm离心10min。离心后去上清，用70%乙醇洗2次，加入300µL TER溶解。然后把溶液放置在4℃冰箱中备用。

（二）DNA聚合酶为Fastpfu酶的扩增

因Taq酶价格便宜，易出结果，并可以修正一些碱基的不配对，但错误率高，所以可用于PCR条件摸索实验中，而在条件确定后可改为保真性较高的Fastpfu酶，既保证扩增效率，又提高了保真性，可以合成较少的特异性弱的产物，正确率较高。PCR体系（25µL）为：19。6µL的H2O，2。5 µL 10×(Faspfu)buffer，1µL的基因组DNA，0。5µL的cel1b-Act-F，0。5µL的Cel1b-R和0。4µL的Fastpfu酶。PCR反应程序为：95℃，2min预变性；94℃，30s变性；60℃，20s退火；72℃，2min延伸。三步为一个循环，进行30个循环后，72℃延伸5min。将产物进行琼脂糖凝胶电泳。

（三）琼脂糖凝胶回收cel1b(exDNA导纳凝胶回收试剂盒)来*自-优=尔,论:文+网www.youerw.com

从凝胶中切要回收的cel1b条带，置于2ml离心管，称重加入3倍大小的Buffer DS。凝胶体积按1mg=1ml算。在上述试管中加入3ul exDNA Milk(使用时摇匀)，置于55℃至凝胶溶解（注：如果胶溶解后变紫色，说明pH偏碱性，可加入少量3M醋酸钠（pH5。2）,使溶解液变偏黄色，可提高回收效果。）将上述试管取出摇匀片刻，于最高速离心45s即可，去上清液，再取200ul Buffer DS将乳白色沉淀溶解，可在Vortex震荡，重复离心步骤得乳白色沉淀。取500µL Washing Buffer加入试管中洗涤沉淀。Vortex震荡，溶解后即离心45s。将所得沉淀再次洗涤，将上清液吸净，控干，可通风加速控干过程。（注：第一次洗涤后，沉淀可能不能很好地溶解,这并不影响回收效果。）沉淀控干后加入20µL双蒸水（或TE缓冲液），震荡溶解沉淀即可，离心，上清液即含回收DNA。

用Nanodrop法测回收DNA的浓度。其方法步骤为：打开电脑，选择Nanodrop2000程序软件，待初始化完成后选择“Nuclear acid”，进行初始化，之后在仪器的加样处先加入5µL TE Buffer洗涤，再加入1。5ml TE Buffer盖上盖子，点击“Black”选项，进行校零，用纸轻轻吸干样品孔的TE Buffer，最后加入1µL待测DNA溶液，合盖，点击“Measure”，电脑即可生成测量结果，通过260/280的值观察DNA纯度。 β-葡萄糖苷酶cel1b的克隆研究(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_83385.html