本实验通过EMS诱导籼稻品种“蜀恢”，得到一个发芽延迟的突变体deg1，该突变体与野生型相比，株高矮小，叶片细长，萌发时间比野生型长，萌发率低下，只有野生型的三分之二左右，萌发速率缓慢，萌发势比较低。本实验通过图位克隆的方法，对该突变基因进行定位，通过对内源性激素含量的分析，对deg1突变体的发芽率低下，发芽时间延长的生理机制进行解释。

1 材料与方法

1。1 水稻材料

    本研究使用的水稻材料包括SH（蜀恢）、deg1（发芽延迟突变体），deg1是水稻品种蜀恢经 EMS诱变处理获得，经连续多代自交，突变性状遗传稳定。水稻种子浸种后在30℃恒温箱中萌发，3-5d后将发芽的水稻种子播种于人工气候室中，水培培养，培养液每4-5 d 更新1次，营养液配方见表1。1。人工气候室培养条件为：恒温30℃，光照/黑暗时间各为14h/10h，光照强度为20000Lux。

表1。1 水稻水培营养液配方

Fig1。1 Rice nutrient solution formula

名称 药品 含量（mg/L）

组分I NH4NO3 91。4

CaCl2 88。6

组分II MgSO4·2H2O 324

组分III K2SO4 71。4

组分IV NaH2PO4·2H2O 40。3

组分V FeSO4·7H2O 34。8

组分VI MnCl2·4H2O 1。5

H3BO3 0。934

(NH4)。Mo7O24·4H2O 0。074

ZnSO4·7H2O 0。035

CuSO4·5H2O 0。031

1。2实验方法

1。2。1 图位克隆

    图位克隆又称为定位克隆，是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法。该方法分离目的基因无需预先知道目的基因的DNA 序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，使用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA 文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步行逼近目的基因或通过染色体登陆的方法最终找到包含该目的基因的克隆，最后通过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列[6]。文献综述

图位克隆的第一步是构建用于标记定位的作图群体，本实验中突变体deg1与“蜀恢”杂交再自交的所得F2代作为初步定位的系统，一般情况下选取50-100株纯合体即可。提取用于定位植株的DNA，将这些DNA进行混合，建立初步定位用的混池，用均匀分布在水稻12条染色体上的110对左右的SSR分子标记逐步进行PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析比对产物和亲本的条带，筛选出与目标基因具有连锁反应的分子标记。混池连锁标记确定之后，开始单株连锁标记定位，使用筛选出的分子标记进行单株连锁验证，将目标基因定位于较窄的区域内，一般在30Kb到50Kb之间，这其中可能包含2-3个功能基因，通过序列比对分析，设计引物，进行PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析比对产物和亲本的条带。为了更精确的定位基因我们需要一个更大的F2群体，一般需要1000株以上的纯和体，群体越大，基因定位就越精确。定位完成后，将这几个候选基因扩增出来并测序，通过比对分析数据查看是否存在碱基序列的变化。找到候选目标基因后，一般还要进行互补实验验证，观察表型是否恢复，最终确定目标基因。 水稻发芽延迟突变体deg1的分离和基因克隆(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_85778.html