1。2  实验方法

1。2。1  DNA提取

本研究采用SDS法提取水稻基因组DNA，提取步骤如下：

1）剪下水稻叶片 2-3cm（约50-100mg），放入1。5mL的离心管中。写上标记，将离心管中放入液氮中降温，再置于全自动快速碾磨仪中振动，4500rpm1min，即获得叶片粉末；

2）加入300μLDNA 提取液并混匀，75℃恒温水浴30min，每10min振荡混匀一次；

3）加入300μL氯仿并振荡混匀，75℃恒温水浴10min后于12000rpm离心10min；

4）吸上清于新的1。5mL离心管中，加入300μL异丙醇，4℃静置10min后于12000rpm离心10min；

5）弃上清，用75%的乙醇溶液洗涤DNA沉淀，并于8500rpm离心5min；

6）弃上清，风干后加入200μL ddH2O，于-20℃保存备用；

1。2。2  分子标记检测

1。2。2。1  PCR扩增

20μLPCR反应体系如下：

组分 Component                       体积 Volume（μL）

2×Taq Mix              10

Forward primer（10μM）           1

Reverse primer（10μM）             1

DNA                 2

ddH2O          6

PCR扩增反应的程序为：94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃保温；

1。2。2。2  琼脂糖凝胶电泳

1）制作琼脂糖凝胶，浓度为5。0%。取14克琼脂粉溶于280mlTAE中，微波加热至无小气泡产生即可置于平板中冷凝，约半小时；

2）取PCR产物10μL，于琼脂糖凝胶中点样；

3）在TAE电泳缓冲液中电泳，电压220V，时间约为1小时；

4）通过紫外凝胶成像系统，扫描凝胶，获得图像，分析样品与双亲标记的多态性。

2 过程与原理文献综述

2。1  实验过程

2。1。1  混池连锁标记 

从F2群体中选取20个突变表型植株，提取DNA，进行PCR扩增，凝胶电泳，根据双亲多态性不同进行筛选，多态性不同的引物即为候选引物，此时候选引物范围较大。

2。1。2  单株连锁标记     

选取F2群体中突变体表型的植株200株，提取DNA，编号1-200，取编号1-200的植株为模版，野生型水稻9311和ZH11为亲本，用110对引物进行PCR扩增，电泳后，通过紫外凝胶成像系统进行多态性分析，与ZH11多态性一致的记录为a，与9311多态性一致的记录为A，有两个或两个以上的条带的记录为h，结果发现在五号染色体上的引物的多态性较为一致，所以粗定位SG1基因位于五号染色体上PP3268和PA3010之间。

2。1。3  扩大模板数量   

扩大模板数量，另外取一批种子进行水培，进行编号，提取DNA，以此为模板，野生型水稻9311和ZH11为亲本，在五号染色体PP3268与PA3010之间设计引物，进行PCR扩增，电泳分析后确定SG1位于五号染色体上，并精细定位到PM446和YP320，其中有7个ORF，而sg1在第四个ORF上，是第1212个碱基发生突变。

2。1。4  基因克隆   

交由公司进行基因克隆 

2。2  实验原理

2。2。1  DNA提取原理

2。2。1。1  磨样

为提高DNA浓度，叶片研磨需彻底，因此采用液氮。液氮因其在常温下快速挥发的性质，是一种极强的制冷剂，可以促使水稻冻裂，为研磨带来极大便利。并且低温情况下各种酶处于低活性状态,有利于抑制Dnase的作用,保护DNA。来*自~优|尔^论:文+网www.youerw.com +QQ752018766* 水稻小粒突变体sg1的分离和基因克隆(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_86151.html