1。3 毛状根及其培养

发根农杆菌即便在不够良好的条件下也能使毛状根生长。当侵染植物时，会在感染部位或者是其周围产生毛状根(hairy root)。毛状根是发根农杆菌所含Ri质粒(root inducing plasmid)的T-DNA（transferred DNA）片段在植物细胞基因组中插入、转化为植物基因组，使外源基因整合并表达，诱导植物细胞形成的不定根[2, 3]。多毛状根部具有在外源植物生长调节剂的情况下，在体外生长的这一独特性状。这些生长特性及发根农杆菌的转化频率，都提高了生产复合植物在体外和体外工具测试根系生物学基因的功能的效率。毛状根具有一些代表性的形态特征，最具有代表性的是有明显的分支状，并且无向地性，这也表现与区分了毛状根与别的根系的不同的特点。并且，毛状根还可以在没有植物激素的培养基上，自主性地快速生长发育，迅速分支。毛状根在解剖学上保持了植物原根系统的特征；在生理上具有原根系统完整的代谢通路，毛状根起源于单细胞而不存在嵌合体，在遗传上具有高度的稳定性和一致性[4-6]。

由于一条毛状根起源于一个细胞，所以将每条毛根作为一个单一的克隆体，然后在含有抗生素的培养基上进行培养，也可用高温(37至40℃)除菌，直到完全除菌。转化根在不加外源激素的培养基上会快速生长，表现为多分支且无向地性。在建立发根培养系统时，主要挑选较为粗壮，充满活力的毛状根系，分支较多且生长速度较快速的。删选去已经细小、断裂或者明显不具备生命活力的根系，要保证发根率。对于毛状根，增殖培养是很关键的一项实验步骤：我们一般将毛状根浸置于盐浓度较低（稀释倍数高）的溶液中进行培养，若浓度过高则会降低毛状根的生长活性，对增至培养造成影响。还可将毛状根进行悬浮振荡培养，一般低速振荡过夜，吸收较为充分。毛状根在培养过程中一般是处于恒温的条件下，也可以暗处理，在毛状根培养基上遮盖上黑布，挡住阳光。注意适当通入空气以保证毛状根可以更好的生长，促进分支。文献综述

1。4 代表菌种

黄瓜碱型发根农杆菌中的代表性菌种NCPPB2659又称为K599，是由澳洲学者Allen Kerr从土壤中分离而得，其含有内源性Ri质粒pRi2659。pRi2659全长为185462 bp，其中T-DNA全长为14982 bp（GenBank登录号：EU186381）。T-DNA区域依次含有orf2、orf3、orf4、orf8、rolA、rolB、rolC、rolD (orf13)、rolE (orf13a)、orf14和cus共11个基因，其中orf4为orf3内的套嵌基因（图1）[10]。

 黄瓜碱型发根农杆菌K599 Ri质粒T-DNA结构示意图

研究证实K599中rolA（又称为rolα）、rolB（又称为rolβ）和rolC（又称为rolγ）3个基因与K599侵染植物诱导毛状根形态构成以及发育有关，cus基因为黄瓜碱合成基因[11, 12]。此外，有较多研究报道表明，从其它类型农杆菌中克隆的同源性rolA、rolB、rolC以及roD也与毛状根的形成有关[13]。Hansen G等认为甘露碱型发根农杆菌8196 rolE（orf13a）为一类调控蛋白[14]，而Aoki S等认为orf14能协助rol系列基因促进根的诱导[15]。Otten L和Helfer A研究报道，发根农杆菌A4 orf8基因影响植物体内糖的代谢，Umber M等报道转orf8基因烟草植株变矮、出现杂色[16, 17]。

我们前期通过PCR技术从发根农杆菌代表菌K599中克隆获得了orf3基因，通过多次重复克隆实验和测序，验证结果为orf3的编码区（ORF）为1479bp，编码492个氨基酸。通过Blast比对，我们发现Mankin SL等报道的K599 orf3基因与我们克隆的orf3基因相比，在编码区第1090bp后多出1个碱基T，这样导致编码区提前出现终止密码子；而我们克隆的orf3基因编码的蛋白质与Moriguchi K等报道从异黄瓜碱型发根农杆菌Ri质粒pRi1724 orf3基因高度同源一致[10, 18]。来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766- 发根农杆菌K599T-DNA上orf3基因的原核表达(2):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_87961.html