1。6  本课题的研究内容及意义

在海藻糖的运用上，已经在上文简略的介绍过了，不管是在生产还是在生活中，海藻糖都有非常广泛的运用。为了更好的让海藻糖运用于产业化上，我们需要在最低成本的情况下，获得最高的海藻糖产量。这就要求我们在各个方面最优化 例如寻找最适温度，最适时间，最适加入表面活性剂的含量，以寻求获得最大海藻糖产量。本课题利用固定化全细胞催化合成海藻糖，通过加入生物表面活性剂硫酸粘杆菌素，使得细胞的通透性增加，不造成细胞死以及不破坏胞内酶系结构的情况下改变细胞壁和细胞膜的通透性，使得底物和产物能够无阻碍地进出细胞。在保证细胞通透性的同时，也要保证细胞内的整体结构完整，不能破坏胞内海藻糖合成酶以及所在酶系的完整，使海藻糖合成酶能够持续循环催化[20]，最大限度的提升海藻糖产量，在海藻糖产业化的进程中大大的降低生产成本。

2  实验材料与方法

2。1  实验材料

菌种：重组大肠杆菌BL21菌株，本实验室构建。

培养基：

加氨苄的LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，氨苄抗生素0。1 g/L。

平板加氨苄抗生素的LB固体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，氨苄抗生素0。1 g/L，琼脂20 g/L。

主要试剂：硫酸粘杆菌素购于Ruibio公司，液相分析用色谱纯麦芽糖、海藻糖、葡萄糖购于Sigma公司，分析纯麦芽糖购买于中国惠兴生物化学试剂有限公司。

主要设备：高效液相色谱仪UltiMate3000（美国Dionex公司）；恒温摇床HYL-A（太仓市强乐实验设备厂）；低温高速离心机3-30K（德国Sigma公司）；超声破碎仪GA88-II（无锡上佳生物科技有限公司）。

2。2  实验方法

2。2。1  重组大肠杆菌发酵生产海藻糖合成酶

将大肠杆菌BL21接种在加氨苄的LB培养基中，摇瓶培养控制条件在37 ℃，200 rpm培养，期间取样用分光光度计测量细胞浓度值，当培养细胞浓度至OD600 0。6-0。8时加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导剂的终浓度为0。8 mM，诱导时间为8 h[21]。

2。2。2  通透性大肠杆菌的制备

添加硫酸粘杆菌素对湿菌体进行透性化处理，在摇床培养200 rpm的条件下对硫酸粘杆菌素浓度、处理时间、处理温度进行单因素实验。在测定最适硫酸粘杆菌素浓度条件时，温度设置为25℃，反应时间设置为60 min，设置硫酸粘杆菌素的浓度梯度为1。0 g/L、1。2 g/L、1。5 g/L、1。7 g/L、2。0 g/L；在测定最适处理时间条件时，选取1。5 g/L硫酸粘杆菌素在25℃条件下处理大肠杆菌细胞，处理时间梯度设置为为30 min、60 min、90 min、120 min；在测定最适处理温度条件时，选取1。5 g/L硫酸粘杆菌素作用于大肠杆菌细胞，反应时间为60 min，处理温度梯度设置为25℃、28℃、30℃、33℃、35℃。

每一次单因素处理结束后，都要在高速离心机中离心发酵液，条件为6000 rpm下10 min，离心后得到的湿菌体用磷酸盐缓冲液洗涤2次，并1/2体积重悬，固定细胞菌悬液浓度为10%。得到的细胞悬浮液用于接下来的海藻糖的合成。

2。2。3  酶活测定

取15 mL的通透性处理的细胞悬浮液与50 mL的30%（W/V）麦芽糖底物，在25℃，200 rpm条件下反应30 min，反应结束后，将混合液置于沸水浴中，加热10min，灭活。

从沸水浴里取出混合液，放于离心机中，5000 rpm，离心时间10min，取上清液，用于后续酶催化反应测海藻糖含量。 

酶活力单位定义：在25℃，每l min生成l nmoL海藻糖所需的酶量为1个酶活力单位。文献综述 硫酸粘杆菌素处理重组大肠杆菌生产海藻糖合成酶的研究(4):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_89218.html