（4）蛋白酶检测培养基（1000 ml）

A液（500 ml）：脱脂奶粉10。0 g，加无菌水定容至500 ml，分装后115 ℃，灭菌15 min

B液（500 ml）：酵母提取物10。0 g，琼脂15。0-17。0 g，加无菌水搅拌混匀后定容至500 ml，分装后121 ℃灭菌20 min

灭菌后A液与B液1:1混合

（5）纤维素酶检测培养基（400 ml）

取2 g酵母提取物、0。4 g (NH4)2SO4、1。6 ml 50%甘油、0。04 g MgSO4、8 ml 50×磷酸盐缓冲液(350 g K2HPO4 + 100 g KH2PO4 + 1 L dH2O, 调pH至6。9–7。1，最后加入0。1 g/100 ml羧甲基纤维素钠和1。7 g/100 ml细菌琼脂粉，加纯水搅拌溶解后定容至400 ml，分装后121 ℃灭菌20 min。

1。1。3  抗生素及其浓度    本研究中涉及到的抗生素及其配制溶剂和浓度见表1-2。

表1-2  抗生素及其使用浓度文献综述

Table 1-2  Antibiotics and the application concentration

抗生素 缩写 溶剂 母液浓度mg/ml 使用终浓度μg/ml

卡那霉素 Km H2O 100 50 

利福平 Rif C2H6O 100 100

硫酸庆大霉素 Gm H2O 100 50

1。1。4  菌株培养及保存    培养菌株E。 coli：液体培养一般在37 ℃摇床进行，200 rpm培养10-14个小时；固体培养在37 ℃培养箱过夜。培养菌株Pcc：液体培养一般在28 ℃摇床进行，200 rpm培养12-24个小时；固体培养在28 ℃培养箱1天。菌种保存：短期保存，Pcc划线或涂布于含抗生素的LA平板上，E。 coli保存在含相应抗生素的LA平板上，贮存在4 ℃冰箱，每3-4周重新划线保存；长期保存，将新鲜培养的菌液与等体积的50 %灭菌甘油充分混合后保存或冻干贮存于-70 ℃冰箱。

1。1。5  主要试剂和仪器    引物合成和测序由金智公司完成；细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购于Axygen公司；细菌RNA提取试剂盒购于Bioteke公司；限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、r-Taq聚合酶、反转录试剂盒PrimeScriptTM RT Reagent (Perfect Real Time)Kit均购于TaKaRa公司；杂交用地高辛试剂盒购于Roche公司。冷冻离心机、PCR仪和分光光度计为Eppendorf公司产品；凝胶成像系统为Bio-Rad公司产品。

1。1。6  引物和限制性内切酶

表 1-3  本研究所用引物及其序列

Table 1-3  The sequences of PCR primers used in this study

Primers Primer sequence and Restriction Enzyme cutting site Restriction Enzyme Source

rsmB-F 5'-GGGGTACCCTTGAGCGTTGTATTCGT-3' Kpn I This study

rsmB-R 5'-CCCAAGCTTTGTTCTGATTCACGGATG-3' Hind Ⅲ This study

1。2  缺失突变体的构建

1。2。1  质粒的提取    质粒的提取参照OMEGA质粒DNA小量试剂盒说明书进行：

1)挑取所需大肠杆菌单菌落于含相应抗生素的LB培养基中37 ℃振荡培养16小时； 胡萝卜软腐果胶杆菌rsmB基因致病相关功能分析(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_89615.html