（1）将旋转蒸发后的十大功劳乙醇浓溶液加入萃取瓶中静置。

（2）分层后（24小时左右），将下层溶液分出，放入超声混合机器中进行超声，强化提取工艺，提高产物提取率，促进固体溶解。

（3）分出的上层溶液则进行旋转蒸发。

（4）将超声后的下层溶液再倒入萃取瓶中，并加入两瓶正己烷，静置分层，并重复步骤（2）（3）（4）。

此实验过程需要不断重复，使用不同极性的溶剂来对提取物进行重复萃取，从而达到充分萃取的过程。提取物经不同极性溶剂萃取后，乙酸乙酯段用葡聚糖凝胶柱色谱法分离，根据色谱图分组收集。

2。4。2葡聚糖凝胶柱色谱法

本实验采用Sephadex LH-20凝胶柱层次分离纯化技术，研究阔叶十大功劳叶中乙酸乙酯段单体化合物的提取分离和纯化方法，以期得到纯度较高的单体化合物，并将得到的单体化合物作为下一步实验的必要材料[16,17]。

2。4。2。1 预处理

实验步骤如下：

（1）制备洗脱剂：用蒸馏水和100%的甲醇，配制80%、60%、40%、20%的甲醇溶液，进行梯度洗脱。

（2）上柱：将处理过的凝胶用甲醇作溶剂搅拌成糊状，并将其缓缓倒入色谱柱中。加入的凝胶在柱内溶剂中首先分散，同事随着下降的溶剂在柱内均匀沉降，凝胶沉降到2-3cm时，用针筒不断从管口沿柱壁缓慢加入第一个洗脱剂（防止加入的洗脱液将凝胶表面冲坏），使凝胶内的杂质冲出，最后使洗脱液的凹液面与凝胶相切，然后关闭活塞[1]。

2。4。2。2 上样

实验步骤如下：

（1）将乙酸乙酯萃取段旋转蒸发的最终浓缩干燥的十大功劳提取物用20%的甲醇溶液溶解，加入甲醇溶液的量根据提取物溶解度来加，一般在一到二毫升左右，量越少样品浓度越大，则分离的效果越好。

（2）待洗脱液洗脱至刚好露出凝胶表面时用针筒吸取样品沿柱壁旋转缓缓加入，加完样品后，等到样品下落至刚好露出凝胶表面时再用针筒沿柱壁旋转缓缓打下20%的甲醇洗脱液洗脱，当溶液页面和凝胶上表面的距离足够时，可以直接倒入洗脱液，并洗脱一段时间。文献综述

2。4。2。3 洗脱收集

实验步骤如下：

（1）备好一定数量的干净的小玻璃瓶，瓶子的容量在三到五毫升左右，用来收集相应组分。

（2）完成上样后，控制洗脱速度，洗脱太快达不到较好的分离效果，并在20%甲醇溶液的洗脱下，因为样品为有色物质，所以可以根据颜色判断样品的洗脱情况。当颜色快接近收集口时开始用事先备好的小玻璃瓶分组收集。

（3）当洗脱一段时间后，柱内的样品不再下落或者小玻璃瓶内不再收集到样品，说明洗脱液浓度不够洗脱样品中的剩余物质，所以需要适当提高洗脱液浓度，将20%的洗脱液换成之前配好的40%的甲醇洗脱液再继续洗脱并用标号编号的小玻璃瓶收集，依次重复此过程直至洗脱液浓度最后换成100%的甲醇来洗脱，直至柱内样品全都洗脱出来。

2。4。2。4 鉴定及分类

实验步骤如下：

（1）配制展开剂：以正丁醇、乙酸、去离子水的3:1:1的比例配制。

（2）点样展开：在硅胶板下端1cm左右处画一条与硅胶板底端平行的直线，在该直线上每隔7cm点一个点，并在每个点上标上编号，用来点样。用毛细管点样针按顺序给洗脱收集的标了编号的小玻璃瓶中的样品液点样。待点样点晾干后分别放到装有展开剂的层析缸中，待溶剂前沿离薄层板1cm左右时将硅胶板取出，晾干[1]。

（3）显色：用浓硫酸作为显色剂，往硅胶板上喷浓硫酸喷雾，并用烤机烤干直至显色。 十大功劳叶中乌苏酸的分离研究(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_89750.html