酶切步骤：将酶切体系放入37℃中水浴2h，之后琼脂糖电凝胶电泳，切胶回收，测量其浓度为14。7ng/µL，A260/A280为1。87。

2。2。2。2 质粒的酶切

1。 质粒DNA的提取

实验前一天晚，挑取大肠杆菌单个菌落至LB培养基（卡那霉素浓度为100µg/ml）中，37℃振荡培养过夜（约16h），将混合液移入2ml 离心管中，以9000rpm/min 的速度离心1min后收集菌体，倒上清液。向沉淀中加入150µL预冷的P1，在涡旋混合仪上震荡直至沉淀溶解。向上述溶液中加入150ul的P2，慢慢颠倒使之混匀，直至液体由浑浊变为澄清，并且打开管盖发现有黏丝。接着再轻轻加入150µL的P3。同样慢慢颠倒混和摇匀，直至出现类似鸡蛋清状的絮状沉淀，以 13000rpm/min 离心6min，取上清420ul加入1ml无水乙醇，以13000rpm/min 离心6min。倒出液体，以13000rpm/min 离心1min，离心完之后把剩余的乙醇烘干（10min），接着加入30µL由RNA酶的的TE溶液，在底部轻弹，以13000rmp/min离心1min。在30℃恒温箱放置10min。

2。 质粒DNA的酶切文献综述

质粒DNA上有XbaI和HindⅢ酶切位点，见图用这两种酶进行双酶切时，可以与cel1a-Pact产生相同粘性末端，因此连接体系中，可以连接在一起。酶切体系（40µL）为：30µL的H2O、4 µL的10×buffer，4µL的质粒DNA，1µL的XbaI，1µL 的HindⅢ，酶切后电泳鉴定，然后进行切胶回收，测量回收DNA浓度。

2。2。2。3 Pact-Bgla与pCAMBIA-1300的连接（Bgla-Pact-pCAMBIA-1300）

  pCAMBIA-1300与Pact-Bgla的连接中，pCAMBIA-1300和Pact-Bgla按照加入后浓度比为1:1加入。连接体系（22µL）为2。5µL H2O 、2µL的10×T4 DNA Ligase buffer、3 µL的质粒载体、12 µL的目的片段 、0。5µL的 T4 DNA Ligase将上述体系置于22°C水浴锅中1h。

2。2。3 重组子的转化与鉴定

  2。2。3。1将重组子导入大肠杆菌感受态细胞

将20µL连接体系和100µL大肠杆菌感受态细胞和5×KCM 30µL，置于冰上30min。再转移到水浴锅中，42℃水浴80s，然后转到冰上2min。加入无抗生素的LB液体培养基 800µL于管中，37℃摇床1h后，7000rpm/min离心3min。移走上清800µL，用黄枪头重悬，混匀，最后涂平板。16小时后观察平板。

2。2。3。2 重组子的酶切

将挑的菌落置于已有2ml的LB培养基（卡那霉素浓度为100µg/ml），12管，180rpm，37℃摇床16h。将摇床过后的菌液倒1。5ml置离心管中，用碱性裂解法提取质粒。之后进行电泳，然后酶切重组子用XbaI和HindIII进行双酶切，将pCAMBIA-1300与Bgla-Pact分开，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2。2。3。3  Bgla基因的序列测定

将克隆得到的β-葡萄糖苷酶Bgla寄去上海测序。

3  结果与分析

3。1  Bgla的PCR扩增

在引物为Bgla-Act-F和Bgla-R将目的基因进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后得出目的基因片段大小接近3100bp左右。β-葡萄糖苷酶Bgla的大小为3163bp，由图2可知PCR鉴定结果正确。Bgla经过Nanodrop法测回收DNA浓度为11。5ng/µL，A260/A280为1。2。

3。2  Pact的PCR扩增

在引物为Bgla-Act-R和XbaI-F将启动子DNA进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后得出启动子片段大小在1000kb以上，在1200-1300之间。启动子的片段大小在1251bp，如图3，电泳检测结果表明得到了预期大小的启动子DNA。Pact经过PCR扩增后，然后用Nanodrop法测回收DNA浓度为20ng/µL，A260/A280为12。5。

3。3  Bgla-Pact的PCR扩增

将目的基因与启动子相连接后，理论上目的基因大小为3163kb，启动子DNA大小为1251kb，加起来为4414kb，经过实验后，如下图4所示，这条带大小接近于4414kb，说明经过连接体系，两者已经成功连接在一起。将Pact与Bgla用重叠PCR的方法连接后，进行琼脂糖电泳回收。来~自,优^尔-论;文*网www.youerw.com +QQ752018766- 里氏木霉中β-葡萄糖苷酶Bgla的克隆(5):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_89751.html