黑曲霉GASBD(s)蛋白与淀粉亲和性的研究(3)

3。1 可溶性重组蛋白GASBD(s)的诱导表达

挑取含有重组质粒pET28a-GASBD(s)的大肠杆菌BL21(DE3)单菌落，分别接种于10 mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃，200r/min振荡培养过夜。分别取2mL过夜培养液，以1:100转接于200mL含50μg/mL卡那霉素的TB培养基中，在37℃，200r/min的条件下，振荡培养到OD600 为0。8时，加IPTG至0。4mM。在25℃继续诱导培养12h。

取1L诱导培养液，在4℃，5000g离心5min后，收集菌体。菌体沉淀用200mL Tris-HCl (20mM，pH8。0) 洗涤两次后重新悬浮于50mL裂解液(20mMTris-HCl, 500mM NaCl, pH8。0)中，冰上放置30min。菌体裂解后在4℃，13000g离心10min后，收集含有重组蛋白的上清液，备用。

3。2 重组蛋白GASBD(s)的纯化

采用金属离子亲和层析法对重组蛋白GASBD(s)进行纯化。具体步骤如下：取2mL Ni2+-NTA树脂(Valencia, CA, USA)装入层析柱中，然后用去离子水将乙醇冲洗干净，再用裂解液进行平衡。含有重组蛋白的的上清液经0。22μm 滤膜过滤后上柱(上样量约20mL)，流速为0。5mL/min。用含有20mM 咪唑的裂解液冲洗柱子，直至层析柱中没有杂蛋白流出，再用5倍柱体积的含有300mM 咪唑的裂解液将重组蛋白从树脂上洗脱下来，洗脱液的流速为1mL/min。收集含有重组蛋白的洗脱液，透析后用超离心过滤装置5000 MWCO (Millipore, Billerica, MA, USA)对样品进行浓缩。浓缩的重组蛋白真空冷冻干燥后贮存于-20℃。

3。3 GASBD(s)重组蛋白与玉米淀粉结合的定性分析

重组蛋白与不溶性淀粉结合的定性分析参照Abou[12]等描述的方法进行，并稍加改动。具体操作如下：准确称取10mg不溶性的玉米淀粉后用100 mM NaAc缓冲液(pH 6。0) 重复洗涤两次。用100 mM NaAc缓冲液(pH 6。0)将纯化的GASBD、GASBD2、GASBD3 或GASBD4重组蛋白配制成浓度分别为50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL蛋白质溶液。分别取1mL不同浓度的蛋白质溶液加入到预洗的不溶性玉米淀粉中，于25℃并轻轻震荡2h。然后在4℃，13000g离心5min。牛血清白蛋白(BSA，200μg/mL)溶液用作阴性对照。最后对未结合的蛋白质和与玉米淀粉结合的蛋白质进行SDS-PAGE分析。

3。4 GASBD(s)重组蛋白的结合曲线

用100 mM NaAc缓冲液(pH 6。0)分别将纯化的GASBD、GASBD2、GASBD3 和GASBD4蛋白溶液调整为15。4、20。6和27。8μM三种不同的浓度。分别取1mL不同重组蛋白的三种不同浓度的蛋白溶液加入到预洗的不溶性玉米淀粉中，于25℃并轻轻震荡。在1、5、10、20、30、60、90、120、180 和240 min时，每一重组蛋白的每个浓度分别取一管用离心(在4℃，13000g离心5 min)的方法终止GASBD（s）蛋白与淀粉的结合反应。用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA) 法测定上清液中未结合的蛋白质浓度，结合的蛋白质浓度根据总蛋白浓度与未结合的蛋白浓度之差来确定。结合的蛋白质浓度用每克淀粉结合多少微摩尔蛋白质来表示(M/g)。

用BCA法测定未与淀粉结合的蛋白质浓度的操作步骤如下：分别取0、1、2、4、8、12、16和20μL BSA (0。5mg/mL)标准溶液到96孔板的标准品孔中，然后用100 mM NaAc缓冲液(pH 6。0)补足到20μL。准确吸取20μL蛋白溶液到样品孔中。各孔加入200μL BCA工作液，充分混匀，于37℃保温30-60min。冷却至室温后，用酶标仪测定562 nm处的吸光值。以制作标准曲线的空白液为对照，测定样品的吸光值，每个蛋白样品重复测定3次，然后计算出样品的蛋白浓度。

3。5 GASBD(s)重组蛋白的吸附等温曲线

准确称取10mg不溶性的玉米或马铃薯淀粉后用100 mM NaAc缓冲液(pH 6。0) 洗涤两次。用100 mM NaAc缓冲液(pH 6。0)将纯化的GASBD, GASBD2, GASBD3 或GASBD4 蛋白配制成浓度分别为1、2、4、6、8、10、15、20和25μM蛋白质溶液。然后分别取1mL不同浓度的蛋白质溶液加入到预洗的不溶性玉米或马铃薯淀粉中，置于25℃并轻轻振荡2h。在4℃下，13000g离心5min后用BCA法测定未与淀粉结合的蛋白质浓度。溶液中总蛋白浓度与未结合的蛋白浓度之差即为与淀粉结合的蛋白质浓度。黑曲霉GASBD(s)蛋白与淀粉亲和性的研究(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_92866.html