定量称取上述物质于烧杯中，加超纯水定容至1000ml, 用1mol/L NaOH（约1ml）调pH至7。2，121℃高压灭菌20min。

(2)固体LB培养基(1000ml) 

     胰化蛋白胨(Tryptone)           10 g

 酵母提取物(Yeast extract)        5 g

     氯化钠(NaCl)                  10g

     琼脂或者琼脂糖                15 g

定量称取上述物质于烧杯中，加超纯水定容至1000ml, 用1mol/L NaOH（约1ml）调pH至7。2，121℃高压灭菌20min。

1。1。3 试验试剂

PrimeSTAR高保真酶、限制性内切酶、r-Taq聚合酶、质粒小量制备试剂盒、胶回收试剂盒，Taq-Plus PCR试剂盒、质粒大量提取纯化试剂盒、氨苄青霉素（Amp）、MES、甘露醇、乙酰丁香酮等。

1。1。4 试验器材

小型离心机、涡旋振荡仪、超净工作台、高压灭菌锅、烘箱、冰箱、恒温摇床、微波炉、电子天平、电热恒温水浴锅、恒温光照培养箱、多功能水平电泳槽、稳压稳流电泳仪、PCR扩增仪、紫外凝胶成像仪、分光光度计、抽滤器、移液枪、电击转化仪、倒置荧光显微镜等。

1。2实验方法

对玉米白草花叶病毒全长测序后获得VPg段序列，构建植物表达载体进行瞬时表达观察其亚细胞定位情况。构建pAN581-VPg-YFP载体，用于聚乙二醇（PEG）介导的玉米原生质体转化，荧光观察VPg蛋白在原生质体中的定位情况。构建pGD-YFP-VPg载体,用于农杆菌的电击转化浸润本氏烟，荧光观察VPg蛋白在烟草表皮细胞中的定位情况。

1。2。1植物表达载体的构建

pAN581-VPg-YFP载体的构建：以PenMV侵染性克隆质粒为模板，以1-F和1-R扩增VPg将核定位信号和核仁定位信号对应的氨基酸突变为丙氨酸，PCR产物割胶回收后用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切后与相同用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切后的载体pAN581连接，并转化到DH5a中用含氨苄青霉素的LB培养基于37°C培养箱培养过夜。以S-F和1-R进行菌落PCR筛选阳性克隆，挑取阳性克隆摇菌提取质粒，PCR验证回收后测序。来;自]优Y尔E论L文W网www.youerw.com +QQ752018766-

pGD-YFP-VPg载体的构建：以2-F和2-R扩增YFP，以3-F和3-R扩增VPg，PCR产物割胶回收后以2-F和3-R进行overlap-PCR，经SalⅠ和BamHⅠ双酶切后，与相同用SalⅠ和BamHⅠ双酶切后的载体pGD连接。以S-F和3-R进行菌落PCR筛选阳性克隆，挑取阳性克隆摇菌提取质粒，PCR验证回收后测序。

引物设计如下：

引物名称

F:上游

R:下游 引物序列和酶切位点

方向：5’-3' 限制性内切酶

1-F GCTCTAGAGCCAAATAATCGCAGG XbaⅠ

1-R CGGGATCCTTGTTCCATCATCATCGA BamHⅠ

S-F GGAGATCTCCCACTATCCTTCGCAAG

2-F GCGTCGACATGGTGAGCAAGGGCGAGG SalⅠ

2-R GAGCTGTACAGATCTGGCAAGTCTAAGAGA

3-F CTTAGACTTGCCAGATCTGTACAGCTCGTC

3-R CGGGATCCTTACTCATGGGTTACGCCTTCT BamHⅠ

1。2。1。1 PrimeSTAR的PCR扩增

体系（50μl）如下：

组分 白草花叶病毒VPg蛋白亚细胞定位研究(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_95668.html