筛选平板培养基(MSM)（Ⅱ）：

分别称取琼脂粉12 g，七水合硫酸镁0。012 g，氯化钠0。06 g，磷酸二氢钾0。12 g，硫酸铵0。12 g于烧杯中，加入200 mL的纯净水溶解，再经过量筒定容至600 mL，电磁炉加热，并玻璃棒充分搅拌至完全溶解沸腾，将两个三角瓶的培养基和22个培养皿放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌30分钟。称取0。02 g底物溶于无水乙醇中配成浓度为1 g/L的底物溶液。再将培养基倒入培养皿，等待平板凝固后再用移液枪吸取1 mL的底物溶液于平板表面，用的涂布棒均匀涂布直至晾干。

丰富平板培养基（Ⅲ）：

分别称取葡萄糖10 g，酵母粉4 g，琼脂粉8 g，七水合硫酸镁0。6 g，磷酸二氢钾1。6 g于烧杯中，先加入200 mL的纯净水溶解，再经过量筒定容至400 mL，电磁炉加热，并玻璃棒充分搅拌至完全溶解沸腾，将两个三角瓶的培养液和16个培养皿放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌30分钟。称取0。0075 g底物溶于无水乙醇中配成浓度为0。5 g/L的底物溶液。再将培养基倒入培养皿，等待平板凝固后再用移液枪吸取1 mL的底物溶液于平板表面，用的涂布棒均匀涂布直至晾干。文献综述

发酵培养基（Ⅳ）：

分别称取葡萄糖30 g，酵母粉12 g，七水合硫酸镁0。9 g，磷酸二氢钾2。4 g倒入烧杯中，加300 mL的纯净水溶解，再经过量筒定容至600 mL，电磁炉加热，并玻璃棒充分搅拌至完全溶解沸腾，将两个三角瓶的培养液和30个离心管放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌30分钟。将600 mL的培养液等量的倒入离心管中，每个离心管中溶液20 mL。

2。5 菌种筛选

（1）将5 g土壤样品加入放有灭菌玻璃珠的30 mL 无菌生理盐水（0。85%，w/v）中，加入5颗左右玻璃珠，在摇床中200 rpm摇匀打散30 min。

（2）静置后取2 ml上清接种于25 ml富集培养基（I），培养12 h后，将发酵液梯度稀释并选取适当浓度10-3涂布于筛选平板培养基（Ⅱ）。

（3）3-5 d后平板表面长出极小菌落，将其转接于平板培养基（Ⅲ），48 h后可生长成直径约2-3 mm菌落。

（4）250 mL三角瓶灭菌并加入50 mL培养基（Ⅳ），接种丰富平板培养基（Ⅲ）上菌落并在30℃，转速180 r/min 条件下发酵培养48 h。之后低温4℃离心6 min，收集菌体，将细胞用生理盐水洗涤两次后进行生物转化反应。

（5）转化具体方法为：

在50 ml具塞三角瓶中，将1 g细胞悬浮于含有5%葡萄糖和2 g/L CPMK，pH7。0磷酸钾缓冲液并定容至5 ml，在30℃，200 r/min 条件下反应36 h。反应结束后，用乙酸乙酯对转化反应液进行萃取，薄层层析（TLC）检测，分散剂为正己烷/异丙醇（9/1，  V/V）。通过 TLC 检测挑选出具有转化6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯能力的菌株，然后对这些菌株的转化能力进行高效液相色谱（HPLC）检测。

2。6 菌株鉴定

可以利用微生物生理生化反应的产物和发酵类型来测定菌株。首先以无菌操作将筛选到的菌株5-1-k4a细胞接种到发酵培养基上，把此培养基置于温度为32℃的全温立式生化培养箱中培养2天后，在超净工作台中用灭菌的牙签将发酵培养基中相似形态的菌落转接在无菌水中，混匀，制成菌悬液，再进行Biolog 菌株鉴定。Biolog鉴定结果表明 5-1-k4a

菌株为季也蒙毕赤酵母细胞（P．guilliermondii） 。来;自]优Y尔E论L文W网www.youerw.com +QQ752018766-

。

2。7 酶活性质测定

将已经得到的菌株5-1-k4a，采用高效液相色谱进行分析。取10 ml发酵液进行离心，收集菌体，并悬浮于10 ml磷酸钾缓冲液(100 mmol，pH7。0)中，同时加入1%底物[(3R，5R)-CDHHB]及6%辅助底物-葡萄糖，在30℃，180 r/min的反应条件下反应4 h。再取样1 ml加入10 μl 盐酸溶液(6 mol/L)进行终止反应，离心后取600 μl上清液，用液相色谱分析产物的生成量。同时取200 μl上清液，NaCl 饱和后加入800 μl乙酸乙酯充分混匀，再次离心。 羰基还原酶产生菌的筛选与分离(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_96001.html